MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞線粒體基因表達(dá)及細(xì)胞增殖和遷移的影響＊

孫美濤，梅 雯，王唯斯，李素芬，自加吉，張曉娟，熊 偉

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的原發(fā)性惡性腫瘤，約占成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的30%~40%，多數(shù)腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，侵襲性強(qiáng)［1］。目前，腦膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，但因腫瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，導(dǎo)致手術(shù)治療不能徹底切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者的預(yù)后極差，因而多需要術(shù)后結(jié)合放化療的綜合性治療［2］。隨著對(duì)腦膠質(zhì)瘤的深入研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)侵襲與多種基因密切相關(guān)，基因靶向治療可能是治療腦膠質(zhì)瘤的一種有效方法［3］。腦膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要的生物學(xué)異常表現(xiàn)是能量代謝的改變，從而使腫瘤細(xì)胞保持更強(qiáng)的增殖、侵襲及在不利環(huán)境中存活的能力［4］。其能量代謝的特征是，即使在有氧的條件下也主要采用糖酵解的方式產(chǎn)生能量，這一過(guò)程受一系列的基因調(diào)節(jié)，并促使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出惡性特征［5］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是環(huán)境致癌物作用的重要靶標(biāo)，其損傷程度和突變率顯著高于核內(nèi)DNA［6］。大量研究表明，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的mtDNA突變和線粒體動(dòng)力學(xué)改變有明顯相關(guān)［7，8］。

線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（mitochondrial transcription termination factor 3，MTERF3） 又被命名為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（mitochondrial transcription termination factor domain containing 1，MTERFD1），是 MTERF 蛋白家族中最保守的成員［9］。人MTERF3基因位于 8q22.1，包含 11個(gè)外顯子［10］。研究顯示，哺乳動(dòng)物MTERF3是一種線粒體蛋白質(zhì)，且負(fù)調(diào)控線粒體DNA的基因表達(dá)和線粒體能量生成［11］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，MTERF3在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中不可缺少，敲除MTERF3基因的小鼠胚胎發(fā)育遲緩并在妊娠過(guò)程中死亡［11］。還有研究報(bào)道，MTERF3基因在細(xì)胞中的作用類似于細(xì)胞癌基因，MTERF3基因拷貝數(shù)擴(kuò)增及其過(guò)表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后有重要作用［12］。然而，目前關(guān)于MTERF3基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制仍不清楚。該研究通過(guò)構(gòu)建MTERF3過(guò)表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，旨在探究MTERF3對(duì)U251細(xì)胞線粒體基因表達(dá)及細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；pEX-EGFP-Flag和pEX-MTERF3-Flag質(zhì)粒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；胰酶消化液、DMSO、D-PBS、青鏈霉素溶液、碘化丙啶（PI）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光液、XTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DL 2000 DNA Marker、基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；Tranwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Roche公司；兔抗MTERFD1多克隆抗體（ab167067）、兔抗GAPDH多克隆抗體 （ab9485）、兔抗 VDAC1多克隆抗體（ab15895）、兔抗 MT-ND1 多克隆抗體（ab222892）、兔抗MT-ND6多克隆抗體 （ab81212）、兔抗MTCYB多克隆抗體 （ab81215）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ab6721）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為3組，空白對(duì)照組：無(wú)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染pEGFPFlag質(zhì)粒的U251細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染MTERF3-Flag質(zhì)粒的U251細(xì)胞。取處于增殖期的U251細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至匯合度為80%～90%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染4~6 h后更換Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)染至48 h，觀察轉(zhuǎn)染效率，拍片。然后用500 μg/ml G418篩選14 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)株，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 半定量PCR檢測(cè)線粒體DNA拷貝量變化按細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞總DNA的提取。為減少DNA模板量的差異，擴(kuò)增核基因組18 S rDNA基因，引物設(shè)計(jì)如下：18 S rDNAF：5'-CGCGCTCTACCTTACCTACC-3'，18 S rDNAR：5'-CCGTCGGCATGTATTAGCTC-3'，調(diào)整各樣品模板濃度。以調(diào)整一致的模板濃度，擴(kuò)增mtDNA的D-loop區(qū)片段，對(duì)mtDNA拷貝量進(jìn)行相對(duì)定量，引物設(shè)計(jì)如下：D-loop-F：5'-GGGAACGTGTGGGCTA TTTA-3'，D-loop-R：5'-TACTCAAATGGGCCTGT CCT-3'。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，凝膠成像系統(tǒng)成像，QuantityOne 4.6軟件 （Bio-rad）分析個(gè)條帶灰度值，以線粒體D-loop與18S rDNA的擴(kuò)增條帶的灰度值比值代表線粒體DNA拷貝量變化［13］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平 取以上3組的U251細(xì)胞，每孔分別加入150 μl Western IP細(xì)胞裂解液（含1.0 mmol/L PMSF），置于冰上30 min，使其充分裂解。12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到各自標(biāo)注好類別的1.5 ml的Eppendorf管內(nèi)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，煮沸變性。各組取100 μg樣品進(jìn)行上樣，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉室溫下對(duì)PVDF膜進(jìn)行抗原封閉1 h。倒掉封閉液，加入TBS-T稀釋的一抗（均以1∶1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。采用Image J軟件測(cè)量每個(gè)條帶的IOD值，計(jì)算各蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 XTT細(xì)胞增殖檢測(cè) 將3組U251細(xì)胞稀釋至1×106/mL，分別向96孔板中加入2000個(gè)細(xì)胞/孔。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，分別在每孔加入50 μl XTT溶液，用鋁箔包裹培養(yǎng)板，于37℃溫育4 h。每孔加150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，溶解殘留的甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm吸收值并繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組U251細(xì)胞，每管加入1 ml預(yù)冷的75%的乙醇溶液固定，置于4℃，固定過(guò)夜。次日，2000rpm，4℃離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清。加入1 ml冰預(yù)冷的D-PBS重懸細(xì)胞，洗2遍，收集細(xì)胞，棄上清。每管加入500 μl的PI染色液，加入RNase A至終濃度0.5 mg/ml，輕輕渦旋重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。利用Novo Express軟件分析熒光強(qiáng)度直方圖，統(tǒng)計(jì)不同處理下各時(shí)相細(xì)胞所占的比例，分析細(xì)胞周期G0/G1、S、G2/M不同時(shí)相分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板底部每個(gè)孔上畫5條平行直線。重懸3組細(xì)胞，分別接種2.5×105/孔于6孔板內(nèi)，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待其匯合度達(dá)90%～95%。用PBS洗滌細(xì)胞3次，再用10 μl的槍頭劃1條垂線，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基置于5%CO2，37℃恒溫箱內(nèi)孵育。最后分別于0、12和24 h時(shí)倒置顯微鏡（100×）下采相，采用Image J軟件計(jì)算圖片上劃痕距離，計(jì)算公式如下：遷移率（%）=（0 h所測(cè)距離－預(yù)定時(shí)間所測(cè)距離）/0 h所測(cè)距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/ml。選用孔徑0.8 μm Transwell小室置于24孔板中，分別向小室中加入1×105個(gè)細(xì)胞和200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基。下室（24孔板）中各加入600 μl完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉小室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min后，再用0.1%結(jié)晶紫染色，PBS漂洗1～3次，至背景呈白色。最后在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)固定視野（×100）拍照，并評(píng)價(jià)各組細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，計(jì)量值以（±s）表示，兩組均值間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均值間的比較采用單因素方差分析。取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的熒光顯微鏡觀察 將空白對(duì)照組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細(xì)胞可以看到清晰明亮的綠色熒光，說(shuō)明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)存在EGFP蛋白的表達(dá)，而空白對(duì)照組觀察不到任何綠色熒光信號(hào)（圖1）。初步的觀察結(jié)果表明，已經(jīng)成功的構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的U251細(xì)胞株。

2.2 過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中MTERF3蛋白的表達(dá)檢測(cè)為進(jìn)一步驗(yàn)證MTERF3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株，使用兔抗MTERF3多克隆抗體對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP-Flag的陰性對(duì)照組細(xì)胞中MTERF3蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯變化（P>0.05）。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEX-MTERF3-Flag的U251細(xì)胞中MTERF3蛋白的表達(dá)比對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞高4.6倍左右，且組間差異極其顯著 （P<0.01），說(shuō)明MTERF3穩(wěn)轉(zhuǎn)的U251細(xì)胞株中，外源MTERF3蛋白能夠持續(xù)的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察U251細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況（×100）

圖2 Western blot檢測(cè)MTERF3蛋白在各組U251細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)線粒體DNA拷貝量的影響 以核內(nèi)18S rDNA基因的水平作為內(nèi)參，以線粒體D-loop擴(kuò)增產(chǎn)物與18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的比值表示線粒體DNA與核DNA含量的相對(duì)比例，分析不同處理的U251細(xì)胞中線粒體DNA拷貝量的變化。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，U251細(xì)胞線粒體DNA拷貝量沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），而過(guò)表達(dá)MTERF3基因能夠顯著抑制線粒體DNA的復(fù)制，導(dǎo)致線粒體DNA拷貝量下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 半定量PCR檢測(cè)MTERF3對(duì)線粒體DNA復(fù)制水平的影響

2.4 MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)線粒體編碼蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 以線粒體蛋白質(zhì)VDAC1作為內(nèi)參，Western blot檢測(cè)MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)線粒體編碼蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，U251細(xì)胞線粒體編碼的ND1、ND6和CYTB蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異 （P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞過(guò)表達(dá)MTERF3后，導(dǎo)致重鏈編碼的ND1、CYTB蛋白和輕鏈編碼的ND6蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)MTERF3對(duì)線粒體編碼蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

2.5 MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組U251細(xì)胞的增殖力在48 h、72 h和96 h時(shí)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖力未見(jiàn)明顯變化（P>0.05）。結(jié)果表明，MTERF3基因過(guò)表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)U251細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖5。

圖5 XTT檢測(cè)MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

2.6 MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞周期的影響與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比顯著減少，S期細(xì)胞百分比顯著增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。此外，3組細(xì)胞處于G2/M期的細(xì)胞百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P>0.05）。結(jié)果表明，上調(diào)MTERF3基因表達(dá)后，能促進(jìn)U251細(xì)胞通過(guò)G1/S控制點(diǎn)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，且未出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖6。

2.7 MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞遷移能力的影響 在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的劃痕愈合率［（68.22±8.53）%］ 顯著高于空白對(duì)照物 ［（42.45±5.43）%］和陰性對(duì)照組［（41.32±5.65）%］。 同時(shí)，在Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)中，MTERF3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組在每個(gè)視野下遷移的細(xì)胞數(shù)［（435.00±42.26）個(gè)］顯著多于空白對(duì)照組［（259.00±30.22）個(gè)］和陰性對(duì)照組［（252.00±27.58）個(gè)］，組間差異非常顯著（P<0.01）。而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖7。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)MTERF3對(duì)U251細(xì)胞周期的影響

圖7 Transwell檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MTERF3對(duì)U251細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是目前人類腫瘤中最為常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，起源于腦組織的神經(jīng)外胚層細(xì)胞，是生存時(shí)間最短及預(yù)后最差的疾病類型之一［14，15］。 近年來(lái)，手術(shù)治療、放療及化療等常規(guī)治療手段取得了較大的進(jìn)步，但由于腦膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)的特性，導(dǎo)致腫瘤部位難以徹底切除而復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響腦膠質(zhì)瘤治療的預(yù)后［16］。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子靶向治療逐漸成為惡性腫瘤新的治療措施。研究表明，MTERF3蛋白能特異性地與線粒體DNA D-loop區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，MTERF3在mtDNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用［11］。由于MTERF3抑制線粒體DNA的基因表達(dá)，所以線粒體DNA所編碼的呼吸鏈復(fù)合體亞基上的蛋白合成也會(huì)受到相應(yīng)的影響，降低細(xì)胞氧化磷酸化水平［17］。Hyvarinen等用二維瓊脂糖凝膠電泳法（neutral/neutral two-dimensional agarose gel electrophoresis，N/N2D-AGE）對(duì)mtDNA復(fù)制中間體的研究發(fā)現(xiàn)，在人胚腎293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MTERF3，抑制線粒體DNA復(fù)制過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA拷貝量下降［18］。此外，MTERF3不僅負(fù)調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，還可以影響線粒體核糖體的合成［19］。MTERF3基因的表達(dá)異常，可能與線粒體心肌病、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、線粒體腦病、惡性腫瘤等人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)［17，20-22］。

該研究在分析了MTERF3過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞線粒體基因表達(dá)水平的影響后，進(jìn)一步采用XTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。XTT結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MTERF3基因能夠顯著促進(jìn)U251細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MTERF3基因的U251細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，促進(jìn)U251細(xì)胞從G0/G1進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)U251細(xì)胞增殖，并且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)均表明，MTERF3穩(wěn)定過(guò)表達(dá)能顯著提高腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的體外遷移能力。

綜上所述，該研究提示MTERF3基因過(guò)表達(dá)能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞線粒體基因表達(dá)，并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。本研究為進(jìn)一步探討MTERF3對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體氧化磷酸化活性及惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。