抗核抗體、抗核抗體譜及其聯(lián)合檢測診斷自身免疫性疾病的價(jià)值比較

郭佳佳，蔣曉欽，李 琰，慕珂珂，董炎紅

自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）是機(jī)體對自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，造成自身組織損害而引發(fā)的疾病，其病因與自身抗原改變、免疫調(diào)節(jié)異常、遺傳等相關(guān)［1，2］，主要表現(xiàn)為器官特異性自身免疫疾病和系統(tǒng)性自身免疫疾病，如甲狀腺功能亢進(jìn)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，對患者身體健康具有不同程度的影響。自身抗體是AID診斷關(guān)鍵，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步使得AID有關(guān)抗體也不斷被發(fā)現(xiàn)，AID檢出率亦明顯提高?？购丝贵w（ANA）是指抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體，而以Hep-2細(xì)胞為基質(zhì)的間接免疫熒光法（IIF）檢測ANA是AID重要篩選實(shí)驗(yàn)［3］。此外，免疫印跡法（IBT）檢測抗核抗體譜（ANAs）亦對AID鑒別和病情評價(jià)具有重要價(jià)值［4］。為了解ANA、ANAs及其聯(lián)合檢測對AID的診斷價(jià)值，筆者將所在醫(yī)院1095例疑似AID患者作為研究對象，進(jìn)行血清ANA、ANAs檢測，觀察其診斷結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月—2018年6月筆者所在醫(yī)院1095例疑似AID患者為研究對象，其中男382例，女713例；年齡4~80歲，平均（41.76±16.92）歲。

1.2 方 法

1.2.1 儀器與試劑 日本奧林巴斯BX50熒光顯微鏡，德國歐蒙EURO Blot MasterII型全自動(dòng)免疫印跡儀，日本佳能公司Lide100掃描儀，歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司提供的ANA檢測試劑盒、免疫印跡試劑盒。

1.2.2 檢測方法 采集所有受檢者清晨空腹靜脈血5 ml，靜置30 min后以3000 r/min離心，分離血清，采用 IIF檢測 ANA，ANA 滴度設(shè)定為 1：100、1：320、1：1000 和 1：3200， 在載片反應(yīng)區(qū)將稀釋的血清標(biāo)本和固定有包被基質(zhì)生物薄片的Hep-2細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，常溫下孵育30 min，清洗封片，操作步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，由2位有豐富經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)師在熒光顯微鏡下進(jìn)行讀片，觀察有無熒光，抗體滴度≥100為陽性。采用IBT檢測ANAs，檢測nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、AMA-M2、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白15種特異性抗體。于膜條上平行抗原，將1：101稀釋的血清標(biāo)本和膜條上靶抗原進(jìn)行反應(yīng)，常溫下孵育，加入酶標(biāo)記抗IgG抗體后再次溫育，跟底物液呈顏色反應(yīng)后進(jìn)行清洗，風(fēng)干后使用掃描儀掃描，以EUROLineScan軟件評估檢測結(jié)果，特異性抗體強(qiáng)度為“+”及以上判為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；ANA、ANAs兩種方法檢測一致性采用Kappa檢驗(yàn)分析，κ<0.4表示檢測一致性弱，0.4<κ≤0.6表示檢測一致性中等，0.6<κ≤0.8表示檢測一致性高，κ>0.8表示檢測一致性極高；以最終確診AID為標(biāo)準(zhǔn)，評估ANA、ANAs及其聯(lián)合檢測對AID的診斷效能，取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA及ANAs陽性標(biāo)本檢測結(jié)果 1095例受檢者血清標(biāo)本中，ANA檢測陽性為511例，陽性率為46.67%（511/1095）；ANAs檢測陽性為490例，陽性率為44.75%（490/1095）。兩種方法檢測結(jié)果符合率為75.80%，檢測一致性κ=0.511，P<0.05。其中ANA（+）/ANAs（+）比率為 33.61%，ANA（-）/ANAs（+） 比率為11.14%，ANA （+）/ANAs （-） 比率為13.06%，ANA（-）/ANAs（-）比率為 42.19%。

2.2 ANA陽性標(biāo)本熒光核型及ANAs檢測結(jié)果在511份血清ANA陽性標(biāo)本中，熒光核型以核顆粒型、核均質(zhì)型、混合型為主；ANA（+）/ANAs（+）標(biāo)本熒光核型中，著絲點(diǎn)型、核顆粒型、混合型陽性率較高。見表1。

表1 ANA陽性標(biāo)本熒光核型及ANAs檢測結(jié)果［例（%）］

2.3 不同熒光滴度ANA陽性率及ANAs陽性率不同熒光滴度ANA陽性率、ANAs陽性率均存在差異，隨著熒光滴度的增高，ANA陽性降低 （χ2=186.643，P<0.05）， 其中，ANAs所占比例逐漸增高（χ2=48.079，P<0.05），見表 2。

2.4 ANAs陽性標(biāo)本中不同特異性抗體類型ANA陽性和陰性情況 490份血清ANAs陽性標(biāo)本中，特異性抗體類型以Ro-52、SS-A和nRNP/Sm為主，ANAs（+）/ANA（+）標(biāo)本中 nRNP/Sm、SS-A 和 Ro-52陽性比例較高，ANAs（+）/ANA（-）標(biāo)本中，Scl-70、PM-Scl、PCNA陽性比例較高。見表3。

表2 不同熒光滴度ANA陽性率及ANAs所占比例［例（%）］

表3 ANAs陽性標(biāo)本中不同特異性抗體類型ANA陽性和陰性情況［例（%）］

2.5 ANA、ANAs及其聯(lián)合檢出率比較 最終診斷結(jié)果顯示，1095例疑似AID者中有668例為AID，ANA 檢出率為 76.50%（511/668），ANAs檢出率為73.35%（490/668），ANA+ANAs 檢 出 率 為 94.76%（633/668），ANA+ANAs 檢 出 率 顯 著 高 于 ANA、ANAs檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=58.332，χ2=78.648，P<0.05）。

3 討論

AID是以自身免疫耐受平衡失調(diào)引發(fā)自身免疫反應(yīng)的一類疾病，其臨床癥狀復(fù)雜多樣，診斷時(shí)容易與感染性疾病或其他系統(tǒng)疾病混淆，導(dǎo)致誤診或漏診，影響患者治療［5，6］。 及早明確診斷是 AID 患者實(shí)施有效治療的基礎(chǔ)，對提高患生存質(zhì)量具有重要意義。IIF是我國臨床實(shí)驗(yàn)室檢測ANA最早的方法，且得到廣泛應(yīng)用，IIF-ANA作為AID診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有敏感度和特異性高、操作簡便、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而，IIF是以Hep-2細(xì)胞為基質(zhì)，其包被抗原存在分布不均勻情況，且部分含量較低，容易發(fā)生特定抗原流失等情況，造成部分特異性抗體漏檢［7，8］。 此外，部分人群在無 AID 情況下，也可檢測出低滴度 ANA，影響結(jié)果判斷［9，10］。 IBT 檢測ANAs也是臨床診斷AID較為常用方法，其操作簡便，特異性高，自動(dòng)化程度高，檢測結(jié)果判讀容易，并且能夠單次檢測多種抗體，長期保存膜條結(jié)果，方便查看［11，12］。

該研究對1095例疑似AID者進(jìn)行血清IIFANA和IBT-ANAs檢測，顯示ANA檢測陽性率為46.67%，ANAs檢測陽性率為44.75%，兩種方法檢測結(jié)果符合率為75.80%，檢測一致性κ=0.511，為中等一致，表明IIF-ANA和IBT-ANAs檢測存在吻合情況，但并非完全一致，不可互為替代。王紅娟等［13］亦對IIF-ANA和 IBT-ANAs檢測情況進(jìn)行探討，顯示兩種方法的檢測結(jié)果一致性為中度（κ=0.503），與該研究結(jié)果較為接近。此外，不同熒光滴度ANA陽性率、ANAs陽性率均存在差異，隨著熒光滴度的增高，ANA陽性降低，ANAs陽性率升高，提示ANA陽性率與熒光滴度存在相關(guān)性，且ANA陽性結(jié)果與ANAs陽性結(jié)果亦有出入，也說明了IIF-ANA和IBT-ANAs檢測不能相互替代。馬華瑜等［14］研究指出，ANA 陽性標(biāo)本中，核顆粒型、核均質(zhì)型是其主要核型，但其未分析ANA與ANAs檢出核型的關(guān)系。該次研究檢驗(yàn)ANA陽性標(biāo)本熒光核型，發(fā)現(xiàn)核顆粒型、核均質(zhì)型、混合型是其主要核型，與馬華瑜等［14］研究結(jié)果相符。 而 ANA（+）/ANAs（+）標(biāo)本中，顯示著絲點(diǎn)型、核顆粒型、混合型陽性率較高，提示核顆粒型、混合型是ANA與ANAs檢出主要核型，且兩種方法對其他核型檢出情況亦存在差異。另一方面，ANAs陽性標(biāo)本特異性抗體類型以 Ro-52、SS-A 和 nRNP/Sm 為主，ANAs （+）/ANA（+）標(biāo)本中nRNP/Sm、SS-A和Ro-52陽性比例較高，ANAs （+）/ANA （-） 標(biāo)本中，Scl-70、PM-Scl、PCNA陽性比例較高，說明ANAs與ANA對特異性抗體類型檢出有差異，進(jìn)行聯(lián)合檢測可提高各類型特異性抗體陽性檢出率，有利于AID分類診斷。陳向華等［15］分析ANA和ANAs檢測AID情況，表示同時(shí)進(jìn)行ANA和ANAs檢測能夠有效提高AID檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。該研究對ANA、ANAs及其聯(lián)合檢出率進(jìn)行比較，顯示ANA檢出率為76.50%，ANAs檢出率為73.35%，分析漏診原因，前者可能是IIFANA檢測中Hep-2細(xì)胞基質(zhì)的包被抗原分布不均勻或含量較低，而后者與IBT-ANAs檢測特異性抗體數(shù)量有限相關(guān)。結(jié)果中ANA+ANAs檢出率顯著高于 ANA、ANAs檢出率（P<0.05），說明 ANA 聯(lián)合ANAs檢測可提高AID檢出率。

綜上所述，盡管ANA、ANAs檢測均能夠檢出AID，但漏檢和假陽性發(fā)生可能性較大，而ANA聯(lián)合ANAs檢測可減少漏檢情況發(fā)生，提高AID檢出率，為臨床診斷提供有效依據(jù)。