口腔黏膜拭子檢測UGT1A1基因多態(tài)性并分析其與伊立替康藥物不良反應的關系＊

賈曉艷，付漢東

伊立替康（CPT-11）是半合成水溶性喜樹堿的衍生物，是DNA拓撲異構酶I抑制劑，多用于結直腸癌、小細胞肺癌的二線治療，也可用于胃癌，非小細胞肺癌、胰腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療［1］。伊立替康在體內的代謝失活依賴于多種酶的作用，其中最重要的屬尿苷二磷酸葡糖苷酸轉移酶1A1（UGT1A1）。UGT1A1多態(tài)性與伊立替康相關的延遲性腹瀉和中性粒細胞減少有密切關系。UGT1A1多態(tài)性多通過采集患者外周血標本進行檢測，該研究以結直腸癌患者口腔黏膜和外周血為檢測標本，分別檢測二者中UGT1A1基因多態(tài)性，探究口腔黏膜拭子提取DNA檢測UGT1A1基因多態(tài)性的可行性，并分析UGT1A1多態(tài)性與伊立替康不良反應之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2017年1月—2018年4月于孝感市中心醫(yī)院治療的110例經(jīng)病理診斷明確，并使用含伊立替康的治療方案的結直腸癌患者，分別取其口腔黏膜和外周血進行UGT1A1基因多態(tài)性檢測。所有患者均知情同意?；熁颊呷糠弦韵聵藴剩海?）所有病例均經(jīng)病理學確診為結直腸癌，并由影像學檢查（CT/MRI或PET-CT等）診斷為復發(fā)或遠處轉移，既往不曾使用過含伊立替康的化療方案，至少存在一個符合實體瘤療效評價標準（RECIST 標準）的可測量病灶；（2）年齡 18～75歲；距末次化療4周以上，ECOG評分為0～1分，預期生存時間≥3個月；（3）無造血功能障礙、無凝血功能異常、無肝腎功能異常；無消化道梗阻；無合并感染。排除標準：（1）合并嚴重的心血管系統(tǒng)疾病或其他合并癥、肝腎功能不全、高血糖狀態(tài)未控制者；（2）精神異常；（3）妊娠及哺乳期；（4）嚴重的免疫功能缺陷。

1.2 方 法

1.2.1 口腔黏膜UGT1A1基因多態(tài)性檢測 患者取樣前30 min未進食、飲水及吸煙等，將一次性口腔拭子伸進口腔，緊靠臉頰內側來回刮拭30次以上，以同樣的方法在另一側臉頰內進行第二根拭子的采樣。采樣完畢后，將拭子裝回采集管，折斷拭子柄多余部分，立即蓋上采集管。采用DP322口腔拭子基因組 DNA提取試劑盒（購自北京天根生化科技公司）提取口腔黏膜拭子中的DNA，并使用紫外分光光度計測定DNA的濃度及純度。提取DNA產(chǎn)物進行 PCR擴增。引物序列： 順義鏈：5’-AGTCACGTGACACAGTCAAACA-3’ ，反義鏈：5’-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’。PCR反應條件：94 ℃，5 min；30 次循環(huán) （94 ℃，30 s；67.5 ℃，20 s；72℃，20 s）；72℃，10 min。 采用焦磷酸測序法進行口腔黏膜UGT1A1基因多態(tài)性檢測。

1.2.2 外周血UGT1A1基因多態(tài)性檢測 抽取患者外周靜脈血2～3 ml，使用全血DNA抽提試劑盒（QIAmp DNA Blood Mini Kit） 提 取 血 液 中 的DNA，并使用紫外分光光度計測定DNA的濃度及純度。提取DNA產(chǎn)物進行PCR擴增，采用焦磷酸測序法進行外周血UGT1A1基因多態(tài)性檢測。

1.2.3 治療方案 所有結直腸癌患者均使用含伊立替康的二線化療方案，加用或不加用分子靶向治療藥物 （貝伐珠單抗或西妥昔單抗）。具體化療方案：（1）FOLFIRI方案。 伊立替康 180 mg/m2，靜脈滴注90 min，第 1天；亞葉酸鈣 400 mg/m2，伊立替康后靜脈滴注2 h，第1天；氟尿嘧啶400 mg/m2，靜脈推注5 min，第 1天；氟尿嘧啶 2400 mg/m2，靜脈持續(xù)泵入46~48 h；每兩周為一個周期。（2）伊立替康聯(lián)合雷替曲塞。伊立替康180 mg/m2，靜脈滴注90 min，第 1天；雷替曲塞 3 mg/m2，靜脈滴注 15 min，第 1天；每三周為一個周期。化療過程中如患者出現(xiàn)3～4級不良反應，則停藥，并給予對癥治療，下一周期將伊立替康減量25%。

1.2.4 藥物毒性評價標準 患者化療后不良反應根據(jù)美國國立癌癥研究所提出的通用毒性標準（NCI-CTC）3.0版對藥物的毒性作用進行評價和分級。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較以及與不良反應的關系采用χ2檢驗或Fisher’s精確概率法。取P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 口腔黏膜拭子與外周血檢測UGT1A1基因多態(tài)性分布情況 110例患者口腔黏膜拭子與相對應的外周血檢測UGT1A1基因多態(tài)性完全一致。其中85例 （77.3%）UGT1A1＊28基因啟動子的TA序列重復 6 次，為野生型 TA6/6（圖 1），21 例（19.1%）為6次和7次重復序列，為雜合突變TA6/7（圖2），4例 （3.6%）為7次重復序列，為純合突變TA7/7。UGT1A1＊6第1外顯子211位點基因型，包括野生型（G/G）（圖 3）82 例（74.5%）、雜合突變（G/A）（圖4）23 例（20.9%）、純合突變（A/A）（圖 5）5 例（4.5%）。

圖1 UGT1A1＊28野生型（T A6/6）測序圖

圖2 UGT1A1＊28雜合突變（TA6/7）測序圖

圖3 UGT1A1＊6野生型（G/G）測序圖

圖4 UGT1A1＊6雜合突變（G/A）測序圖

圖5 UGT1A1＊6純合突變（A/A）測序圖

2.2 UGT1A1基因頻率與Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗 入組的110例患者UGT1A1＊28與UGT1A1＊6等位基因頻率進行遺傳平衡吻合度檢驗表明，抽樣樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性（P>0.05）。

2.3 UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康不良反應的關系 UGT1A1＊28基因突變型 （TA6/7、TA7/7）共25例，其中TA6/7基因型21例發(fā)生3～4級腹瀉共7例（33.3%），3～4級粒細胞減少 7例（33.3%）；TA7/7基因型 4例發(fā)生 3～4級腹瀉 1例（25.0%），3～4級粒細胞減少1例（25.0%）。UGT1A1＊6基因突變型（GA、AA）共28例，其中GA 基因型 23例發(fā)生 3～4級腹瀉共 7例 （30.4%），3～4級粒細胞減少 8例（34.8%）；AA基因型 5例發(fā)生 3～4級腹瀉 2例（40.0%），3～4級粒細胞減少 3例（60.0%）。UGT1A1＊28基因突變型明顯增加3～4級腹瀉及粒細胞減少的風險，UGT1A1＊6基因突變型增加3級以上腹瀉，但與粒細胞減少無顯著相關性。見表1。

表1 UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康不良反應的關系［例（%）］

3 討論

伊立替康是常用的抗腫瘤藥物之一，為細胞周期特異性細胞毒藥物，在體內被羧酸酯酶代謝為SN-38，通過抑制DNA拓撲異構酶I，誘導DNA斷裂損傷、阻斷DNA復制，進而產(chǎn)生抗腫瘤作用［2］。伊立替康在體內失活代謝最重要的酶為尿苷二磷酸葡糖苷酸轉移酶1A1（UGT1A1）。UGT1A1基因多態(tài)性可導致SN-38在體內不能及時滅活，腸道內蓄積增加，進而產(chǎn)生腸道黏膜損傷、遲發(fā)性腹瀉及粒細胞減少等不良反應。UGT1A1基因多態(tài)性研究最多的為UGT1A1＊28和UGT1A1＊6。不同的基因型可影響UGT1A1表達水平及活性的差異，導致伊立替康使用過程中出現(xiàn)不良反應的程度及類型上的差異。UGT1A1＊28多態(tài)性與啟動子的TATA序列重復次數(shù)相關，其中TA重復6次的野生型（TA6/6）最多見，其次為雜合突變型 （TA6/7）和純合突變型（TA7/7）。TA重復次數(shù)越多，UGT1A1表達越少。UGT1A1＊28 基因型為突變型（TA6/7、TA7/7）的患者使用伊立替康后發(fā)生3～4級不良反應的風險較高。UGT1A1＊6基因多態(tài)性發(fā)生于UGT1A1第1外顯子 211 位點，有野生型（G/G）、雜合突變（G/A）、純合突變（A/A）三種基因型。研究結果顯示，相比野生型（G/G），突變型（G/A、A/A）增加了患者發(fā)生 3～4級以上不良反應風險增加。但基因多態(tài)性主要對何種不良反應產(chǎn)生影響，不同研究顯示的結果不同。Oki［3］及 Atasilp［4］的研究均顯示 UGT1A1＊28 與UGT1A1＊6基因多態(tài)性可能導致外周血粒細胞減少。劉靜等［5］的研究提示UGT1A1＊28和UGT1A1＊6突變型較野生型均增加了患者發(fā)生3級以上腹瀉及粒細胞減少的風險。該研究顯示，UGT1A1＊28基因突變型明顯增加3～4級腹瀉及粒細胞減少的風險，UGT1A1＊6基因突變型增加3級以上腹瀉，但與粒細胞減少無顯著相關性。各研究結果結論不同可能與樣本量有關，但均提示UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康的嚴重不良反應相關。因此，在使用伊立替康之前應對UGT1A1基因多態(tài)性進行檢測，如UGT1A1＊28或UGT1A1＊6基因為突變型，使用伊立替康時發(fā)生不良反應的風險較高，建議適當調整給藥劑量或修改治療方案。

口腔黏膜上皮細胞具有代謝旺盛、更新快的特點，易脫落到唾液中［6］。這樣的細胞具有完整的人類基因組 DNA 序列。相關實驗結果表明［7，8］，分別利用來自口腔黏膜拭子里的DNA與血液里的DNA進行基因多態(tài)性檢測，二者測序結果完全一致。為避免口腔黏膜拭子取樣過程中可能出現(xiàn)的細胞取樣數(shù)量不足，本實驗中采樣時口腔內來回刮拭次數(shù)較多，且兩根拭子同時采樣，減少了實驗過程中可能因樣本中細胞數(shù)量不足而出現(xiàn)的誤差。取樣后立即蓋上采集管，減少微生物進入采集管導致的污染。本研究對比口腔黏膜及外周血分別進行UGT1A1基因多態(tài)性檢測，二者結果無差異，提示口腔黏膜提取DNA可取代外周血進行UGT1A1基因多態(tài)性檢測。以口腔黏膜為標本進行基因檢測，具有安全、無創(chuàng)、結果準確、可反復取樣的優(yōu)點，不增加患者痛苦，且取材及樣本處理均相對簡單，適合臨床應用與推廣。

該研究仍存在一些局限性，僅檢測了與藥物療效相關基因的常見突變位點，但不能完全覆蓋檢測基因的所有位點。除UGT1A1＊28和UGT1A1＊6之外，有研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1＊93［9］、UGT1A1＊1［10］等基因多態(tài)性也與伊立替康不良反應有關。未來還需更多大樣本的研究來明確UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康不良反應的關系。

綜上所述，伊立替康的不良反應與UGT1A1基因多態(tài)性密切相關，使用之前進行該基因多態(tài)性檢測有助于臨床醫(yī)師預測化療不良反應的嚴重程度，制定個體化的治療方案與給藥劑量。UGT1A1基因多態(tài)性檢測可使用口腔黏膜拭子與外周血標本，二者檢測準確性相當。臨床醫(yī)師可根據(jù)情況選擇合適的標本進行基因多態(tài)性檢測。