某型潛艇單次長(zhǎng)航前后密閉艙室可培養(yǎng)氣載微生物的病原學(xué)特征分析＊

張耀東，姜美娟，劉玉琳，辛 磊，梁 冰

研究不同環(huán)境下空氣微生物種類的分布及其隨環(huán)境條件變化而發(fā)生的變化規(guī)律是衛(wèi)生微生物學(xué)的任務(wù)范疇［1］。潛艇在水下航行作業(yè)時(shí)，艙室相對(duì)密閉，空氣交換受限，加之作業(yè)環(huán)境中人員密度大，該環(huán)境的生物安全就顯得十分重要。前期對(duì)該環(huán)境的調(diào)查顯示，長(zhǎng)時(shí)間封閉使艙室空氣中微生物濃度明顯升高，微生物的構(gòu)成也發(fā)生了明顯變化［2］，這些變化于健康是不利的。該文將從病原學(xué)的角度，分析長(zhǎng)航前后某潛艇艙室氣載微生物變化的意義，旨在能夠?qū)υu(píng)價(jià)職業(yè)衛(wèi)生潛在風(fēng)險(xiǎn)及制定生物防御措施有參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)條件 航行前：某型潛艇位于碼頭時(shí)可使艙室與外界可進(jìn)行空氣交換。航行后：某型潛艇單次60 d連續(xù)航行，航行中不定時(shí)與海洋大氣進(jìn)行短暫的空氣交換。封艙后艙內(nèi)溫度18～22℃，濕度38%～60%。

1.2 采樣點(diǎn) 分別選取采樣點(diǎn)5個(gè)，涵蓋潛艇前中后部以及上、下層空間。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及材料

1.3.1 空氣微生物采樣方法 采用固體撞擊式采樣，采樣高度1.5 m。采集時(shí)長(zhǎng)5 min，氣體流量為28.3 L/min。操作按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 細(xì)菌學(xué)鑒定方法 采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDITOFMS）技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌鑒定分類。用滅菌的取菌環(huán)挑取適量單個(gè)菌落放入1.5 ml Eppendorf管，加入300 μl純水混勻，再加入900 μl無(wú)水乙醇混勻，靜置 15 min 后離心（13000 r/min，2 min），棄上清后按推薦的甲酸提取法標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。采用MALDI-TOFMS的鑒定軟件MALDI Biotyper RTC進(jìn)行樣品的數(shù)據(jù)采集和鑒定，質(zhì)譜儀線性正性模式用頻率60 Hz，采集分子量為2000~20000 Da的蛋白質(zhì)。每一個(gè)樣品的蛋白質(zhì)譜在不同位置經(jīng)過(guò)160次的激光點(diǎn)擊而獲得，采集到的蛋白峰信息經(jīng)過(guò)軟件進(jìn)行校正，然后與儀器內(nèi)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而得到鑒定結(jié)果。分值2.0～3.0為種的鑒定水平，1.7～1.999為屬的鑒定水平。

1.3.3 抗生素敏感性試驗(yàn) 采用K-B紙片法，操作規(guī)程及結(jié)果判定遵從美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）制定的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》［3］。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料 脫纖維綿羊血胰酶水解大豆瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自濟(jì)南百博生物科技有限公司，作為固體撞擊式采樣器的可培養(yǎng)微生物采集介質(zhì)。甲酸、純乙腈、α-氰-4羥基苯丙烯酸 （HCCA）、三氟乙酸（TFA），購(gòu)自德國(guó)布魯克公司，用于細(xì)菌鑒定。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Anderson CA6型采樣器 （青島眾瑞智能儀器有限公司生產(chǎn)）；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MicroflexTM MALDI-TOFMS），德國(guó)布魯克公司出品。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中各類計(jì)數(shù)資料和比率變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 航行前后可培養(yǎng)微生物氣溶膠菌種構(gòu)成及數(shù)量變化 航行前后生物多樣性明顯增加，可培養(yǎng)微生物由21個(gè)屬56個(gè)種，變?yōu)?7個(gè)屬80個(gè)種。見(jiàn)表1。

表1 航行前后檢出細(xì)菌的數(shù)量變化

表1顯示航行前革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌為主的厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)占62.82%，航行后下降為29.75%；絲狀真菌航行前為14.23%，航行后上升為34.66%。表2顯示，航行后應(yīng)值得重視的為念珠菌和革蘭陰性桿菌明顯增加，尤其是腸桿菌科細(xì)菌的數(shù)量增多。航行前后菌種發(fā)生比較明顯的變化表現(xiàn)為菌種交替出現(xiàn)及數(shù)量改變。

2.2 航行后所分離部分細(xì)菌的抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果 葡萄球菌除對(duì)糖肽類、氨基糖苷類及利福平全部敏感外，對(duì)所檢測(cè)的其他10種抗生素都存在不同程度耐藥。航行前后菌株的耐藥性發(fā)生變化，其中青霉素、氨芐西林和紅霉素航行前后菌株的耐藥性是明顯增加的。航行后葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥率升高8.25%，表示這部分細(xì)菌攜帶mecA基因，對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素菌有耐藥性。同時(shí)其對(duì)紅霉素的耐藥率上升高達(dá)15.45%。見(jiàn)圖1。

檢測(cè)了航行后腸桿菌科細(xì)菌對(duì)20種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示，所分離的腸桿菌科細(xì)菌除了對(duì)碳青霉烯類、氟喹諾酮類、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南和替卡西林/克拉維酸全部敏感外，對(duì)其他12種抗生素均有不同程度耐藥，推測(cè)可能存在廣譜或超廣譜β內(nèi)酰胺酶。見(jiàn)圖2。

表2 航行后消失或新檢出細(xì)菌屬及種類的變化及其數(shù)量

檢測(cè)了不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌（航行后）對(duì)16種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示，所分離的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌除了對(duì)頭孢吡肟、美洛培南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星和米諾環(huán)素全部敏感外，對(duì)其他11種抗生素均有不同程度耐藥。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖1 航行前后葡萄球菌對(duì)16種抗生素的耐藥率（航行前n=40，航行后n=66）

圖2 腸桿菌科細(xì)菌對(duì)20種抗生素的耐藥率（航行后n=19）

圖3 不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌對(duì)16種抗生素的耐藥率（航行后n=20）

在此次研究過(guò)程中，某型潛艇在航行前的艙室內(nèi)菌種構(gòu)成以芽孢桿菌、葡萄球菌、微球菌為主，符合一般空氣環(huán)境中氣載微生物的構(gòu)成特征［1］，而長(zhǎng)航后艙室內(nèi)發(fā)生微生物構(gòu)成的變化，如長(zhǎng)時(shí)間接觸將可能對(duì)艇員的健康構(gòu)成威脅。本次調(diào)查揭示了該作業(yè)環(huán)境中可培養(yǎng)微生物的構(gòu)成情況，對(duì)于感染病原菌的臨床判斷提供了客觀依據(jù)：（1）艙室內(nèi)腸桿菌科細(xì)菌的出現(xiàn)具有重要臨床意義。腸桿菌科細(xì)菌是在溫血?jiǎng)游锬c道中的偏利共棲菌和病原菌［2］，這些細(xì)菌的致病機(jī)制為其表達(dá)的黏附素，可以介導(dǎo)細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面進(jìn)一步侵入宿主細(xì)胞［4，5］。航行中長(zhǎng)時(shí)間暴露在該條件致病菌微生物氣溶膠環(huán)境下，對(duì)艙內(nèi)作業(yè)人員自身健康存在潛在負(fù)面影響，導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，如污染的氣溶膠將會(huì)導(dǎo)致艇員呼吸和消化系統(tǒng)疾病多見(jiàn)［6］。（2）航行后檢出種類較多的念珠菌，并且曲霉菌和青霉菌的比例和數(shù)量也明顯增多。曲霉菌有明確的致病意義，能引發(fā)超敏反應(yīng)和全身性真菌病［1］。念珠菌在環(huán)境中廣泛存在，是人體皮膚及腸道正常菌群的一部分，當(dāng)機(jī)體的免疫防護(hù)系統(tǒng)遭到破壞可以侵染組織［7，8］，引起反復(fù)淺層感染或嚴(yán)重的系統(tǒng)感染［9］。

細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要有細(xì)菌耐藥的遺傳機(jī)制和生化機(jī)制，細(xì)菌耐藥性是細(xì)菌重要的病原學(xué)特征［10］。長(zhǎng)航前后密閉艙室可培養(yǎng)氣載微生物的病原學(xué)分析顯示，航行后艙室菌種構(gòu)成的改變?cè)黾恿藲廨d微生物的致病性，為可能的感染病原菌判斷提供了客觀依據(jù)。潛艇艙室氣載微生物對(duì)常用的抗菌藥物具有一定的耐藥性。細(xì)菌的耐藥譜對(duì)于可能發(fā)生的感染治療有重要的參考價(jià)值，是抗感染經(jīng)驗(yàn)治療的依據(jù)。同時(shí)，細(xì)菌的耐藥譜為執(zhí)行長(zhǎng)距離航行抗菌藥物攜帶準(zhǔn)備有重要的指導(dǎo)意義，對(duì)于抗感染的及時(shí)有效治療有重要的現(xiàn)實(shí)意義：（1）葡萄球菌是一種常見(jiàn)的社區(qū)感染病原菌。但在該環(huán)境下的葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥率達(dá)到了38.46%，此類葡萄球菌將同時(shí)表現(xiàn)對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素菌具有抗性。（2）無(wú)論是航行前還是航行后葡萄球菌對(duì)紅霉素的耐藥率均高，分別是57.63%和73.08%，可以推測(cè)紅霉素不適宜作為航行中常備藥物單獨(dú)使用。（3）腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)81.82%，對(duì)于一代頭孢菌素和二代頭孢菌素的耐藥率分別是54.55%、36.36%，因此航行中可針對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的耐藥性分析選擇對(duì)敏感抗生素，避免選擇上述種類抗菌藥物，以起到治療及時(shí)有效的目的。

長(zhǎng)航密閉艙室環(huán)境中存在的細(xì)菌，除了對(duì)呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，無(wú)論是直接沉降還是間接接觸微生物氣溶膠粒子，都可能在創(chuàng)口創(chuàng)面上造成定植、繁殖、感染［11］，造成艇員不同程度的致病。因此，長(zhǎng)航中除有針對(duì)性地?cái)y帶必需的抗菌藥物外，建立有效的凈化消毒措施是最直接且非常必要的，應(yīng)使作業(yè)環(huán)境的空氣更安全可靠，減少艇員不必要的致病，對(duì)保持機(jī)體的健康狀態(tài)具有重要意義。