絞股藍(lán)對(duì)糖尿病腎病大鼠免疫功能的影響

郎志芳 劉蘭濤 王洪偉 李姝

DN是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一， 在我國(guó)， DN已成為血液透析的重要病因和糖尿病患者的主要死因［1］。目前，對(duì)DN還沒(méi)有很好的治療措施， 因此研究DN發(fā)病機(jī)制， 尋找有效的治療手段對(duì)防治DN具有重大意義［2］。本次研究的目的在于觀察并探討絞股藍(lán)對(duì)DN免疫功能的影響， 以40只大鼠作為研究樣本展開(kāi)研究， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 本次研究共選取均為正常飼養(yǎng)環(huán)境下實(shí)驗(yàn)用大鼠40只， 隨機(jī)分為正常參考組、DN比對(duì)組、絞股藍(lán)高劑量組、絞股藍(lán)中劑量組、絞股藍(lán)低劑量組， 每組8只。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ①大鼠質(zhì)量在200～280 g。②實(shí)驗(yàn)用DN大鼠具備相應(yīng)特征， 符合大鼠糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 研究方法 正常參考組均為正常大鼠。除正常參考組外， 其他組大鼠均腹腔注射STZ， 制備DN模型， 然后給予絞股藍(lán)治療， 其中， 絞股藍(lán)低劑量組的絞股藍(lán)藥量為5 g/kg， 絞股藍(lán)中劑量組為10 g/kg， 絞股藍(lán)高劑量組為20 g/kg。

1.4 觀察指標(biāo) 10周后觀察并對(duì)比各組大鼠TNF、IL-1、IL-6、 CD4+、CD8+和Th1、Th2以及免疫器官指數(shù)。其中TNF、IL-1、IL-6以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定， Th1、Th2經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示， 采用t檢驗(yàn)， 多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05指標(biāo)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①TNF、IL-1、IL-6水平：五組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=108.91、22.23、5.71，P＜0.05)， 且正常參考組＜絞股藍(lán)高劑量組＜絞股藍(lán)中劑量組＜絞股藍(lán)低劑量組＜DN比對(duì)組；提示絞股藍(lán)可有效降低DN大鼠的TNF、IL-1、IL-6水平， 且有明顯的劑量依賴性。見(jiàn)表1。②CD4+、CD8+、Th1水平：五組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.72、13.89、22.34，P＜0.05)；CD4+水平：正常參考組＜絞股藍(lán)高劑量組＜絞股藍(lán)中劑量組＜絞股藍(lán)低劑量組＜DN比對(duì)組；CD8+和Th1水平：正常參考組＞絞股藍(lán)高劑量組＞絞股藍(lán)中劑量組＞絞股藍(lán)低劑量組＞DN比對(duì)組；提示絞股藍(lán)在CD4+、CD8+、Th1指標(biāo)表達(dá)中具有劑量依賴性。見(jiàn)表2。③Th2、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)水平：各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.69、36.85、64.84，P＜0.05)；提示應(yīng)用絞股藍(lán)后DN大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均增加， 且具有明顯的劑量依賴性。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較( ±s, pg/ml)

表1 各組大鼠TNF、IL-1、IL-6水平比較( ±s, pg/ml)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) TNF IL-1 IL-6正常參考組 8 50.34±6.12 18.10±2.93 11.36±2.01 DN 比對(duì)組 8 59.46±5.17 25.39±3.71 18.32±3.48絞股藍(lán)高劑量組 8 53.17±5.78 19.64±2.62 13.29±2.75絞股藍(lán)中劑量組 8 56.79±4.98 22.61±2.88 15.49±2.43絞股藍(lán)低劑量組 8 57.14±4.92 23.05±3.02 15.67±3.04 F 108.91 22.23 5.71 P 0.00 0.00 0.00

表2 各組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較( ±s)

表2 各組大鼠CD4+、CD8+和Th1水平比較( ±s)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) CD4+(%) CD8+(%) Th1(‰)正常參考組 8 35.48±4.05 23.87±3.08 32.87±4.11 DN 比對(duì)組 8 45.39±4.76 17.89±2.78 21.78±3.20絞股藍(lán)高劑量組 8 37.69±4.23 22.51±3.12 29.69±4.73絞股藍(lán)中劑量組 8 42.03±4.87 20.30±2.96 24.83±3.55絞股藍(lán)低劑量組 8 42.34±4.62 20.11±2.90 24.22±3.47 F 71.72 13.89 22.34 P 0.00 0.00 0.00

表3 各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較( ±s)

表3 各組大鼠Th2、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)水平比較( ±s)

注：五組比較, P＜0.05

組別 只數(shù) Th2(‰) 胸腺指數(shù)(mg/10 g) 脾臟指數(shù)(mg/10 g)正常參考組 8 20.57±5.21 38.24±4.28 46.51±4.53 DN 比對(duì)組 8 33.25±4.88 28.95±4.19 34.87±3.99絞股藍(lán)高劑量組 8 22.17±4.73 36.03±5.01 43.18±4.34絞股藍(lán)中劑量組 8 29.45±4.67 32.51±4.03 37.25±4.03絞股藍(lán)低劑量組 8 29.68±4.79 31.88±4.16 37.12±4.10 F 23.69 36.85 64.84 P 0.00 0.00 0.00

3 討論

3.1 研究背景 DN的發(fā)病機(jī)制及其進(jìn)行性腎損害的機(jī)制至今尚未完全明了。而腎小球硬化是多種原因?qū)е履I小球損傷和病變的共同結(jié)局， 也是腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)。而炎癥和免疫功能異常可導(dǎo)致、加重腎臟損傷， 導(dǎo)致DN的發(fā)生［3，4］。

絞股藍(lán)含有絞股藍(lán)皂苷、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、黃酮類、糖類、無(wú)機(jī)元素纖維素和維生素等， 2002年3月5日國(guó)家衛(wèi)生部(現(xiàn)衛(wèi)健委)將其列入保健品名單。絞股藍(lán)的功能有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗心肌缺血缺氧和腦缺氧、脂代謝調(diào)節(jié)、腎臟和肝臟保護(hù)作用等， 但是關(guān)于絞股藍(lán)影響DN的免疫功能研究報(bào)道相對(duì)較少， 本次研究的目的就在于探討絞股藍(lán)在DN大鼠中對(duì)其免疫機(jī)能的影響， 從而為臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)積累。

3.2 對(duì)免疫功能的影響 大鼠灌服絞股藍(lán)煎劑10 g/kg或30 g/kg， 連服 10 d， 可明顯增加脾臟重量 ， 體重亦比正常參考組明顯增加， 能明顯促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)血中膠體碳粒的廓清速率， 提高單核細(xì)胞的吞噬功能， 30 g/kg劑量亦可使胸腺重量增加［5］。

正常大鼠灌服絞股藍(lán)共50 mg/kg， 連服10 d， 對(duì)脾重呈雙相調(diào)節(jié)作用， 即對(duì)于小于中位數(shù)的脾重(mg/10 g體重)可使之增加， 大于中位數(shù)的脾重則使之減??；對(duì)胸腺重量(mg/10 g體重)小于中位數(shù)者無(wú)明顯影響， 大于中位數(shù)者亦可使之明顯減小。DN大鼠灌服絞股藍(lán)200 mg/kg或400 mg/kg， 連服10 d，可明顯對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的胸腺和脾臟重量減輕。小鼠灌服絞股藍(lán)水煎醇沉水提物0.5 g/kg、1.0 g/kg和2.0 g/kg， 連服5 d， 可增加胸腺重量， 1.0 g/kg及2.0 g/kg時(shí)才能增加脾重。DN大鼠灌服絞股藍(lán)400 mg/kg， 連服5 d， 對(duì)環(huán)磷酰胺所致胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)重量的減輕有明顯拮抗作用， 但對(duì)正常動(dòng)物免疫器官重量則無(wú)明顯影響。

國(guó)外有研究表明， DN大鼠灌服絞股藍(lán)皂苷300 mg/kg，連服7 d， 對(duì)體重、脾臟和胸腺重量均無(wú)明顯影響， 但能顯著加強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能［6］。α-半乳糖誘發(fā)的小鼠亞急性衰老模型， 灌服3%絞股藍(lán)浸膏(含生藥150%)混懸液， 連服50 d， 可使明顯升高的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞的百分率降低至接近正常參考組；使降低的中性粒細(xì)胞百分率升高至接近正常參考組；DN大鼠胸腺萎縮， 脾重增加， 用藥后胸腺指數(shù)恢復(fù)， 脾指數(shù)也恢復(fù)正常；DN組血清溶菌酶含量顯著降低，提示機(jī)體抗感染力下降， 服藥組溶菌酶含量顯著增加并超過(guò)DN大鼠組， 這提示應(yīng)用絞股藍(lán)后DN大鼠免疫機(jī)能得到改善。

除了研究免疫指標(biāo)與免疫器官指數(shù)外， 還通過(guò)酶聯(lián)吸附法動(dòng)態(tài)測(cè)定了實(shí)驗(yàn)大鼠IL-2分泌情況， 應(yīng)用不同劑量的絞股藍(lán)大鼠可發(fā)生不同的免疫應(yīng)激反應(yīng)， 10 μg/ml應(yīng)用絞股藍(lán)時(shí)，大鼠脾臟和淋巴細(xì)胞可在刀豆蛋白A和脂多糖誘導(dǎo)下增殖，當(dāng)劑量提高到200 μg/ml時(shí)大鼠脾淋巴細(xì)胞自發(fā)性增殖。

3.3 關(guān)于絞股藍(lán)的毒理研究 雖然在研究中發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)對(duì)免疫機(jī)能的改善功能具有劑量依賴特征， 但為探究絞股藍(lán)的毒理作用， 進(jìn)一步增加絞股藍(lán)使用量， 當(dāng)增加至1000 mg/kg時(shí)(灌服)， 實(shí)驗(yàn)大鼠未在72 h內(nèi)死亡， 隨著給藥方式和劑量的調(diào)整， 可以確定腹腔注射的半數(shù)致死量為1850 mg/kg， 口服5 g/kg、10 g/kg均可見(jiàn)毒性， 且大鼠一般情況、體重增長(zhǎng)、進(jìn)食量、血、尿常規(guī)和病理組織學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。

3.4 實(shí)驗(yàn)總結(jié)和應(yīng)用前景 本項(xiàng)目具有較充分的前期研究工作。在前期工作中已經(jīng)從絞股藍(lán)抗氧化應(yīng)激， 抗腎臟纖維化， 及其對(duì)炎性因子的影響方面證實(shí)了其對(duì)DN有一定的治療作用， 為此次實(shí)驗(yàn)積累一定經(jīng)驗(yàn)。硬件條件：實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備齊全， 實(shí)驗(yàn)用試劑充足， 研究人員具備足夠的專業(yè)知識(shí)， 實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)充足。

綜上所述， 絞股藍(lán)在DN臨床中有良好的應(yīng)用效果， 可有效改善患者免疫功能， 從而有利于患者身體健康和生活質(zhì)量的提高。