L-脯氨酸修飾金納米通道的制備及應(yīng)用

甘惠玉， 黃 露

(閩江學(xué)院海洋學(xué)院， 福建 福州 350108)

手性是自然界的基本特征之一。手性對(duì)映體進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，其生命活動(dòng)的過程(代謝轉(zhuǎn)化、排泄)往往會(huì)存在對(duì)映體選擇性，而且手性物質(zhì)的生物效應(yīng)(致畸、致癌、致突變)也會(huì)呈現(xiàn)對(duì)映體選擇性。在當(dāng)前主要的手性拆分方法，如膜拆分法、色譜拆分法、酶拆分法、化學(xué)拆分法和結(jié)晶拆分法中，膜拆分法能量消耗低、設(shè)備裝置簡(jiǎn)單、操作可持續(xù)并適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，因此近年來獲得了廣泛關(guān)注。

近年來，仿生納米通道，由于其制備材料多樣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高、易于進(jìn)行化學(xué)或生物修飾，引起了研究人員的普遍興趣。仿生納米通道的應(yīng)用主要集中在以下幾個(gè)方面：響應(yīng)型納米流體器件[1]、生物傳感[2]、能量轉(zhuǎn)化[3]以及過濾[4]等。相對(duì)于這些領(lǐng)域，仿生納米通道作為手性傳感器在手性分離分析方面的研究還比較少。其中，Bayley課題組制備了基于α-溶血素酶蛋白的生物納米通道，利用單分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)布洛芬和薩利多安對(duì)映體進(jìn)行手性識(shí)別[5]，之后他們又在這種生物納米通道上，利用銅離子絡(luò)合物與氨基酸對(duì)映體相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基酸對(duì)映體的手性識(shí)別[6]。李海兵課題組將β-環(huán)糊精修飾的PET仿生單納米通道用于組氨酸對(duì)映體的選擇性識(shí)別[7]，隨后他們又將牛血清蛋白直接用于未經(jīng)修飾的PET仿生單納米通道，實(shí)現(xiàn)了對(duì)精氨酸對(duì)映體的手性識(shí)別[8]。黃杉生課題組在納米通道手性拆分方面做了許多工作：將β-環(huán)糊精修飾的二氧化硅納米通道用于苯丙氨酸對(duì)映體的手性拆分[9]；將L-半胱氨酸修飾的金納米通道用于青霉胺對(duì)映體的手性拆分[10]；以聚碳酸酯膜為基底，自聚合多巴胺后得到聚多巴胺納米通道膜，將殼聚糖與其共價(jià)連接后用于苯丙氨酸對(duì)映體的手性拆分[11]；利用殼聚糖修飾的金納米通道對(duì)組氨酸對(duì)映體進(jìn)行拆分，并結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)D-組氨酸和L-組氨酸進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)[12]。

本研究以聚碳酸酯膜為基膜，由化學(xué)沉積法制備金納米通道膜，以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸為研究對(duì)象，考察L-脯氨酸修飾后金納米通道的手性拆分性能。鑒于L-脯氨酸的氨基在水溶液中帶正電，會(huì)與帶負(fù)電的金納米通道表面產(chǎn)生靜電吸引從而修飾在納米金表面，且其不具有紫外吸收，不會(huì)干擾研究對(duì)象的檢測(cè)，所以將L-脯氨酸用于金納米通道膜的修飾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

UV2450紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器蘇州有限公司)；BSZ10S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；THZ-82水浴恒溫振蕩器(金壇市易晨?jī)x器制造有限公司)；PHS-3C臺(tái)式pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；PFC磁力攪拌器(上海山岳科學(xué)儀器有限公司)；GZY-P20-W超純水機(jī)(湖南科爾頓水務(wù)有限公司)。

多孔聚碳酸脂膜(PC膜，100 nm，Whatman公司)；L-色氨酸、D-色氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和L-脯氨酸(純度99%，上海源葉生物科技有限公司)；亞硫酸金鈉(常州化工研究所有限公司)；其他試劑均為分析純，用水為超純水。

1.2 L-脯氨酸修飾金納米通道的制備

采用化學(xué)沉積法制備金納米通道。首先將PC膜放入無水甲醇中浸泡30 min；用水洗滌后，放入含有0.026 mol氯化亞錫和0.007 mol三氟乙酸的甲醇/水(50∶50，V/V)溶液中，置于水浴恒溫振蕩器中震蕩45 min(25 ℃)；放入甲醇中漂洗3次，隨后放入新制取的0.029 mol銀氨溶液中10 min，然后用甲醇、水各清洗3遍；將PC膜放入鍍金液中(含有0.001 25 mol碳酸氫鈉、0.05 mol甲醛、0.063 6 mol 亞硫酸鈉和7.9×10-4mol亞硫酸金鈉，pH=10)，4 ℃恒溫8 h；沉積好的PC膜用25%硝酸浸泡12 h，空氣中晾干備用。將制備好的金納米通道膜浸入1 mmol L-脯氨酸中，室溫放置24 h，水洗3遍后晾干備用。

1.3 氨基酸對(duì)映體的滲析實(shí)驗(yàn)

將制備的復(fù)合膜固定在自制的膜滲析裝置中，該裝置以濃度差為驅(qū)動(dòng)力。膜左側(cè)為50 mL 含有0.2 mmol單個(gè)氨基酸對(duì)映體的50 mmol磷酸二氫鈉溶液，右側(cè)僅為50 mmol磷酸二氫鈉溶液。滲析實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，每隔1 h從右側(cè)溶液中取出一定量的樣品并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。將被分離物質(zhì)的濃度隨過膜時(shí)間的變化定義為對(duì)映體的分離度α：

α=KD/KL， (1)

其中KD為D型氨基酸的過膜速率，KL為L(zhǎng)型氨基酸的過膜速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖1 3種氨基酸對(duì)映體在L-脯氨酸修飾的金納米通道膜中的滲透情況 Fig.1 Permeation of three pairs of amino acid enantiomers in the L-proline modified gold nanochannel membrane

2.1.1 鍍金時(shí)間對(duì)分離度的影響

鍍金時(shí)間會(huì)影響納米通道孔徑的大小，從而影響膜通量及膜的滲透性。以酪氨酸為例，考察鍍金時(shí)間(6、7、8、9、10 h)對(duì)酪氨酸對(duì)映體分離度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鍍金時(shí)間短，孔徑大，過膜速度快，氨基酸對(duì)映體與納米通道修飾物來不及作用，導(dǎo)致對(duì)映體分離度??；鍍金時(shí)間長(zhǎng)，孔徑小，過膜速率慢，兩者的差異不明顯。與其他鍍金時(shí)間相比較，8 h的鍍金時(shí)間分離度最佳，即鍍金時(shí)間的最佳選擇為8 h。

2.1.2 pH對(duì)分離度的影響

以酪氨酸為例，考察磷酸鹽緩沖液pH值(4.68、5.18、5.68、6.18、6.68)對(duì)酪氨酸對(duì)映體分離度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)pH值小于酪氨酸的等電點(diǎn)(pI=5.68)時(shí)，酪氨酸的分離度隨著pH的增大而增大，在酪氨酸的等電點(diǎn)時(shí)分離度達(dá)到最大，當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，分離度卻隨pH的增大而減小。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)下，酪氨酸分子間的靜電斥力最小，分子間的相互作用增強(qiáng)，對(duì)映體之間的差別得以放大。因此，最后選用氨基酸的等電點(diǎn)作為緩沖溶液的pH值。

2.1.3 離子強(qiáng)度對(duì)分離度的影響

以酪氨酸為例，考察磷酸鹽緩沖液濃度(10、25、50、75、100 mmol)對(duì)酪氨酸對(duì)映體分離度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其濃度從10增大到50 mmol時(shí)，酪氨酸對(duì)映體的分離度也隨之增加；當(dāng)濃度從50增大到100 mmol時(shí)，酪氨酸對(duì)映體的分離度卻隨之減少。最終選取磷酸鹽緩沖液的濃度為50 mmol。

2.2 氨基酸對(duì)映體的滲析實(shí)驗(yàn)

以酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸3種氨基酸對(duì)映體為測(cè)試對(duì)象，根據(jù)1.3部分開展實(shí)驗(yàn)，各氨基酸對(duì)映體在L-脯氨酸修飾的金納米通道膜中的滲透情況如圖1所示。圖1中趨勢(shì)線的斜率即為物質(zhì)的過膜速率，從圖1中可以看出，D型氨基酸的過膜速率均大于L型氨基酸。根據(jù)公式(1)進(jìn)行計(jì)算，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的分離度分別為1.99、1.06和1.54。為了進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)還考察了3對(duì)氨基酸對(duì)映體在原始PC膜以及未修飾的金納米通道膜中的滲透情況(圖2)。原始PC膜及未修飾的金納米通道膜對(duì)3對(duì)氨基酸對(duì)映體幾乎沒有手性選擇性，而L-脯氨酸修飾的金納米通道膜對(duì)酪氨酸和苯丙氨酸具有較好的手性選擇性。

圖2 氨基酸對(duì)映體在不同分離膜中的分離度 Fig.2 Resolutions of amino acid enantiomers in differentseparating membranes

2.3 手性膜的重復(fù)利用性

進(jìn)一步對(duì)手性膜的重復(fù)利用情況進(jìn)行考察。將不做任何處理的手性膜用于酪氨酸對(duì)映體的滲透實(shí)驗(yàn)，連續(xù)使用5次的分離度分別為2.04、1.75、1.58、1.41、1.35。由此可見，未作任何處理的手性膜的重復(fù)性能較差。為了改善膜的重復(fù)利用性，每次使用后，將膜用水浸泡0.5 h后，再將膜放入1 mmol的L-脯氨酸溶液中浸泡1 h。將經(jīng)過處理的手性膜用于酪氨酸對(duì)映體的滲透實(shí)驗(yàn)，連續(xù)使用5次的分離度分別為1.95、1.85、1.82、1.80、1.77。由此可見，處理后的手性膜重復(fù)使用后得到的對(duì)映體分離度變化不大，說明所制備的手性膜經(jīng)過一定處理后可以重復(fù)利用。

2.4 手性選擇機(jī)理

由于金納米通道表面帶負(fù)電，而L-脯氨酸具有帶正電的仲胺，因此通過靜電吸附作用，L-脯氨酸可以修飾到納米金表面。在3對(duì)氨基酸對(duì)映體中，色氨酸由于其分子結(jié)構(gòu)最大，對(duì)映體與L-脯氨酸的相互作用差別最小，手性膜對(duì)其幾乎不具有手性選擇性。而與苯丙氨酸相比，酪氨酸在苯環(huán)上多了一個(gè)羥基(圖3)，這使得其與修飾在金納米通道上的L-脯氨酸能夠形成3點(diǎn)相互作用，增強(qiáng)了手性膜對(duì)其手性選擇性。而對(duì)于酪氨酸對(duì)映體，由于D-酪氨酸和L-酪氨酸的氨基的空間位置不同，因而它們與L-脯氨酸的空間作用力不同，從而導(dǎo)致它們?cè)谕ㄟ^手性膜時(shí)的過膜速率不同。

圖3 酪氨酸對(duì)映體與手性膜之間的相互作用

Fig.3 Interactions between the tyrosine enantiomer and chiral membrane

3 結(jié)論

本文通過靜電吸附將L-脯氨酸修飾在金納米通道膜上制備手性膜，對(duì)可能產(chǎn)生影響的各種條件進(jìn)行了考察，例如金沉積時(shí)間、pH值、磷酸二氫鈉濃度、膜的重復(fù)利用等。在優(yōu)化條件下，考察了酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對(duì)映體在手性膜中的滲透情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-脯氨酸修飾的金納米通道膜對(duì)酪氨酸對(duì)映體手性選擇性最好，苯丙氨酸次之，而對(duì)色氨酸對(duì)映體幾乎沒有手性選擇性。本文結(jié)論為其他手性氨基酸修飾金納米通道膜的制備和應(yīng)用提供了參考。