碳化硅量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)及其生物學(xué)應(yīng)用

康 杰，孫為云，丁紫陽(yáng)，周 喜，雷騰飛，宋月鵬

(1.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院材料工程系，鄭州 450121;2.齊魯理工學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，濟(jì)南 250200;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，泰安 271000)

1 引 言

半導(dǎo)體量子點(diǎn)作為一種新型的熒光標(biāo)記物，在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有及其重要的應(yīng)用。半導(dǎo)體量子點(diǎn)與傳統(tǒng)的有機(jī)染料或熒光蛋白相比，具有發(fā)射光譜窄、化學(xué)及光學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)射光色可調(diào)、激發(fā)范圍寬及其表面特異性蛋白耦聯(lián)水平成熟，為動(dòng)態(tài)顯像、實(shí)時(shí)目標(biāo)跟蹤、原位，DNA檢測(cè)，生物芯片及傳感器等研究提供了新的發(fā)展契機(jī)[1-2]。

目前，量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在人工晶體、生命科學(xué)及農(nóng)業(yè)工程技術(shù)領(lǐng)域中也是較為前沿的研究方向[3]，量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)作為一種新型標(biāo)記技術(shù)，在許多領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。雖然近幾年對(duì)鎘系量子點(diǎn)作為標(biāo)記材料的標(biāo)記技術(shù)研究較為成熟，但是，CdSe、CdTe、CdS等鎘系量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性與其結(jié)構(gòu)尺寸的難以控制在一定程度上阻礙了其在量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用上的進(jìn)一步發(fā)展[4]。近段時(shí)間以來(lái)，由半導(dǎo)體碳化硅制備出的量子點(diǎn)熒光標(biāo)記物，因?yàn)樗纳锵嗳菪浴⒂H水性良好且腐蝕法制備工藝簡(jiǎn)便而日漸為研究者們熟知[5-6]。

基于此，本文利用一步法制備出新型標(biāo)記材料碳化硅量子點(diǎn)，利用其水相溶液對(duì)有、無(wú)根皮苷環(huán)境下的串珠鐮刀菌進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)該菌長(zhǎng)期培養(yǎng)，并對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期熒光成像，以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)串珠鐮刀菌長(zhǎng)期處于根皮苷環(huán)境下的生長(zhǎng)、分裂機(jī)制、深入探索其生長(zhǎng)環(huán)境中根皮苷含量的多少與其生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)的相干性，初步探討了該菌對(duì)連作園中蘋(píng)果幼苗的感染機(jī)理。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 熒光標(biāo)記材料SiC量子點(diǎn)的制備

將40%的氫氟酸、65%的濃硝酸以及分析純硫酸按照V(HF)∶V(HNO3)∶V(H2SO4)=6∶1∶1的體積比配制成腐蝕液。將自蔓延燃燒合成的均質(zhì)β-SiC粉末經(jīng)球磨機(jī)振動(dòng)球磨(約6 h)后倒入上述腐蝕液并在室溫條件下加以攪拌1 h。靜置半小時(shí)后抽取上清液并將余下腐蝕液放置在電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，對(duì)其機(jī)械研磨后加入適量超純水配制成溶液，而后放置于超聲分散儀做超聲處理25 min，將超聲空化、粉碎分散后的SiC顆粒懸浮液放置在高速臺(tái)式離心機(jī)中進(jìn)行一定時(shí)間的高速離心層析剪裁，顆粒尺寸相對(duì)較大的便由于離心力作用而沉于底部，則上層清液即為小尺寸的碳化硅量子點(diǎn)水相溶液。

2.2 活體細(xì)胞試驗(yàn)

在本文中，所使用的串珠鐮刀菌是從連作蘋(píng)果園的腐爛的蘋(píng)果根中分離提純出來(lái)的。詳細(xì)培養(yǎng)過(guò)程是：

首先，刮取兩環(huán)冷藏在霉菌恒溫箱里的斜面菌種，無(wú)菌情況下接種至PD培養(yǎng)基內(nèi)活化；然后，無(wú)菌情況下用量筒分別量菌液(串珠鐮刀菌的PD培養(yǎng)基)90 mL、SiC水相溶液30 mL，混合配制成如表1所示四種不同的菌液試樣，其中V(菌液)∶V(SiC量子點(diǎn)水相溶液)=3∶1。

表1 串珠鐮刀菌菌液處理Table 1 The treatment of fusarium moniliforme sheld lysate

菌液1作為對(duì)照組試樣，菌液2、菌液3、菌液4則分別為加入碳化硅量子點(diǎn)但不同根皮苷含量的生長(zhǎng)環(huán)境；然后將四組菌液試樣放置在振蕩器(恒溫28 ℃)中培養(yǎng)一個(gè)月，培養(yǎng)期間每天分別從四種菌液試樣中抽樣、觀(guān)察(熒光顯微鏡下)、照相及記錄觀(guān)察到不同時(shí)期菌落的分裂和成長(zhǎng)情況。

2.3 儀器表征

利用日本JEOL公司生產(chǎn)的H-9500型透射電子顯微鏡檢測(cè)碳化硅量子點(diǎn)(粉末)微觀(guān)結(jié)構(gòu)、微觀(guān)形貌；利用日本日立公司生產(chǎn)的F-7100型熒光分光光度計(jì)測(cè)試碳化硅量子點(diǎn)(水相溶液)的激發(fā)和發(fā)射光譜；利用美國(guó)珀金埃爾默公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀分析碳化硅量子點(diǎn)表面親有機(jī)物基團(tuán)(巰基)的伸縮指紋區(qū)；利用德國(guó)萊卡公司生產(chǎn)的DMi8-M型倒置熒光顯微鏡觀(guān)察經(jīng)碳化硅量子點(diǎn)標(biāo)記后串珠鐮刀菌活體細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及其侵染蘋(píng)果幼苗根部過(guò)程的動(dòng)態(tài)示蹤。

3 結(jié)果與討論

3.1 SiC量子點(diǎn)的發(fā)光機(jī)理

當(dāng)顆粒尺寸達(dá)到納米量級(jí)的時(shí)候，尺寸限制將引起一系列與體相材料不同的性質(zhì)，如尺寸效應(yīng)、量子限域效應(yīng)等，與常規(guī)體系和微觀(guān)體系不同的是，量子點(diǎn)具有許多獨(dú)特的低維物性，呈現(xiàn)出許多特殊的光學(xué)性質(zhì)；正是由于量子點(diǎn)自身的這些量子效應(yīng)，才使得量子點(diǎn)具有特殊的光學(xué)性能。半導(dǎo)體分為直接帶隙半導(dǎo)體和間接帶隙半導(dǎo)體兩種，而SiC量子點(diǎn)屬于后者，因此尺寸效應(yīng)的影響在其上表現(xiàn)的尤為明顯；當(dāng)量子點(diǎn)受到外界光刺激時(shí)，其體材低能級(jí)價(jià)帶上的電子因吸收外界光子增加能量而向高能級(jí)的導(dǎo)帶躍遷，根據(jù)玻爾茲曼分布特性高能級(jí)電子極其活躍并且具有向低能級(jí)價(jià)帶躍遷的幾率非常大，這種由導(dǎo)帶再次躍遷回價(jià)帶而發(fā)射光子的現(xiàn)象即為碳化硅量子點(diǎn)的光致發(fā)光。

對(duì)共性問(wèn)題進(jìn)行綜合分析，打出“組合拳”。系統(tǒng)根據(jù)預(yù)設(shè)的評(píng)價(jià)規(guī)則，對(duì)全市指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行多層面多維度綜合分析，找出共性問(wèn)題。例如，對(duì)干部廉政守正問(wèn)題進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)全市多家單位在辦理群眾投訴舉報(bào)時(shí)有不及時(shí)、不到位現(xiàn)象，不同程度存在干部不作為、慢作為問(wèn)題。為此，我們依托“民聲通”、政風(fēng)熱線(xiàn)等平臺(tái)，針對(duì)部門(mén)行業(yè)存在的突出問(wèn)題開(kāi)展專(zhuān)項(xiàng)治理，倒逼黨員干部勇于擔(dān)當(dāng)、履職為民，切實(shí)改進(jìn)廣大黨員干部的工作作風(fēng)。

圖1 不同光照條件下水相碳化硅量子點(diǎn)的顏色 (a)白光激發(fā);(b)320 nm單色光激發(fā);(c)340 nm單色光激發(fā)Fig.1 Color of water-phase silicon carbide quantumdots under different illumination conditions(a)excitation under white light;(b)excitation under 320 nm monochromatic light;(c)excitation under 340 nm monochromatic light

3.2 SiC量子點(diǎn)的微觀(guān)形貌及其光學(xué)特性

腐蝕法制備出的碳化硅量子點(diǎn)水相溶液在自然光下呈現(xiàn)RGB值為R:255 G:234 B:180的顏色[9-10]如圖1a所示；在暗室中用手提式紫外分析儀對(duì)其進(jìn)行照射，當(dāng)該分析儀的激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為波長(zhǎng)為320 nm時(shí)，碳化硅量子點(diǎn)水相溶液呈現(xiàn)RGB值為R:196 G:215 B:0的熒光如圖1b所示，而當(dāng)把激發(fā)光波長(zhǎng)調(diào)至340 nm檔位時(shí)，溶液又呈現(xiàn)RGB值為R:41 G:131 B:177的熒光情況，如圖1c所示。碳化硅量子點(diǎn)水相溶液光致發(fā)光顏色隨外界光照條件(激發(fā)光波長(zhǎng))的變化而不同，具體表現(xiàn)為隨激發(fā)光波長(zhǎng)的增加使得量子點(diǎn)光致發(fā)光的顏色出現(xiàn)了紅移。該結(jié)果與宋月鵬等課題組的研究結(jié)果相吻合[11-12]。碳化硅的這一多色熒光特性為同時(shí)標(biāo)記同一客體不同部位的組織、同一組織的多個(gè)細(xì)胞等提供了理論依據(jù)。

通過(guò)F-7100型熒光分光光度計(jì)進(jìn)一步表征水相SiC量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜，選取五個(gè)波長(zhǎng)不同、波長(zhǎng)間隔相同的激發(fā)光，其波長(zhǎng)分別為320 nm、340 nm、360 nm、380 nm、420 nm的激發(fā)光對(duì)一步法制備的碳化硅量子點(diǎn)水箱溶液試樣進(jìn)行激發(fā)測(cè)試，其室溫下光致發(fā)光特征發(fā)射光譜如圖2(a)所示。

圖2 (a)SiC QDs不同波長(zhǎng)激發(fā)光下的發(fā)射譜圖;(b)SiC QDs水相溶液的TEM照片F(xiàn)ig.2 (a)Emission spectra of SiC QDs under different wave;(b)TEM image of aqueous SiC QDs

當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)由320 nm經(jīng)340 nm、360 nm、380 nm以相同波長(zhǎng)間隔地穩(wěn)步增加到420 nm，碳化硅量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度最大值對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)則由415 nm紅移到450 nm的發(fā)射波長(zhǎng)，此結(jié)果驗(yàn)證了碳化硅量子點(diǎn)的量子限制效應(yīng)；同時(shí)也表明小尺寸碳化硅量子點(diǎn)的光致發(fā)光現(xiàn)象。將制備出的碳化硅量子點(diǎn)水相溶液滴到銅網(wǎng)上，而后把它置于高清透射電鏡下觀(guān)察，結(jié)果如圖2b所示。從圖中可以看出，碳化硅量子點(diǎn)納米顆粒近似呈球形，而且其尺寸分布也十分均勻，直徑幾乎均在2 nm左右，而SiC體材料激子波爾(Bohr)直徑為5.4 nm，根據(jù)顆粒尺寸接近或小于體材激子波爾直徑便會(huì)產(chǎn)生光致發(fā)光的原理，在外界光束(波長(zhǎng)合適)的激發(fā)下該量子點(diǎn)水相溶液可形成極為顯著的光致發(fā)光現(xiàn)象。

圖3 碳化硅量子點(diǎn)的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of SiC QDs

在對(duì)碳化硅量子點(diǎn)的腐蝕法制備工藝研究初期，李永、范吉陽(yáng)、孫祥鳴等[5-6,9]都制備出了表面具有羧基、羥基親有機(jī)物基團(tuán)的碳化硅量子點(diǎn)，這在一定程度上提高了其親水性、生物相容性；然而，本課題組通過(guò)向腐蝕劑中添加適量的耦合劑(分析純硫酸)，便一步法制備出了表面具有除羧基、羥基外而且還含有巰基(-SH)的碳化硅量子點(diǎn)，圖3是碳化硅量子點(diǎn)的傅里葉變換紅外線(xiàn)(FTIR)光譜，通過(guò)紅外光譜圖的指紋區(qū)可以非常明顯的看出，吸收峰為614 cm-1的位置檢測(cè)到強(qiáng)烈的伸縮振動(dòng)，而這正是親有機(jī)物基團(tuán)-SH的伸縮振動(dòng)指紋區(qū)。

巰基的存在不僅使得與其一端連接的碳化硅量子點(diǎn)具有非常強(qiáng)的親水性，而且更重要的是，巰基的另一端非常容易與特定物質(zhì)(例如特定蛋白質(zhì))結(jié)合，由此可知，巰基在碳化硅量子點(diǎn)表面的成功耦合，為以后醫(yī)學(xué)、生物學(xué)特異性標(biāo)記技術(shù)的實(shí)現(xiàn)及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

3.3 串珠鐮刀菌的標(biāo)記與成像

對(duì)未添加量子點(diǎn)標(biāo)記材料的菌液試樣(菌液1)、添加量子點(diǎn)標(biāo)記材料的菌液試樣(菌液2)在相同的無(wú)菌、恒溫條件下培養(yǎng)3 d，滴到載玻片并將其置于DMi8-M型倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，調(diào)節(jié)顯微鏡上的激發(fā)光波長(zhǎng)檔位，把檔位撥至藍(lán)光(約340 nm)時(shí)對(duì)當(dāng)前視野拍攝照片，其結(jié)果如圖4所示。

從拍攝結(jié)果可以看到，菌液1(無(wú)量子點(diǎn)標(biāo)記材料)在熒光顯微鏡下視野中不能看到任何菌落及其生長(zhǎng)狀況如圖4a，而菌液2(含量子點(diǎn)標(biāo)記材料)在熒光顯微鏡下透出明亮的熒光如圖4b。將產(chǎn)生明亮熒光的菌液2試樣置于波長(zhǎng)為340 nm的激發(fā)光下持續(xù)1 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯微鏡視野中菌液2的熒光強(qiáng)度沒(méi)有絲毫減弱，這表明作為間接帶隙半導(dǎo)體的碳化硅量子點(diǎn)，雖然發(fā)光效率較低，但相比于有機(jī)熒光染料具有極強(qiáng)的抗漂白能力，其光學(xué)性能表現(xiàn)極其穩(wěn)定。這為實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞及其亞結(jié)構(gòu)的標(biāo)記奠定了光學(xué)基礎(chǔ)。

圖4 (a)無(wú)SiC QDs的菌液1(340 nm的藍(lán)光激發(fā));(b)有SiC量子點(diǎn)的菌液2(340 nm的藍(lán)光激發(fā))Fig.4 (a)Without SiC QDs(excited wavelength 340 nm);(b)with SiC QDs(excited wavelength 340 nm)

圖5 經(jīng)SiC標(biāo)記的鐮刀菌的長(zhǎng)時(shí)程成像(a)15 d;(b)30 dFig.5 Long-term imaging for fusarium moniliformewhich labeled by SiC QDs (a)15 d;(b)30 d

考察根皮苷對(duì)串珠鐮刀菌分裂機(jī)制、生長(zhǎng)的影響必須確保熒光標(biāo)記材料滿(mǎn)足對(duì)該菌標(biāo)記的長(zhǎng)時(shí)程性，前期研究中，孫祥鳴等[9]利用SiC量子點(diǎn)對(duì)出牙短梗霉菌的熒光成像實(shí)驗(yàn)中提到了長(zhǎng)時(shí)程性，宋月鵬等[11]在研究尖孢鐮刀菌的分裂機(jī)制時(shí)也驗(yàn)證了碳化硅量子點(diǎn)的熒光標(biāo)記長(zhǎng)時(shí)程性。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)試樣菌液2進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)(10～40 d)，間隔地對(duì)試樣取樣(15 d、30 d熒光成像)，觀(guān)察其是否也能滿(mǎn)足SiC量子點(diǎn)對(duì)串珠鐮刀菌標(biāo)記的長(zhǎng)時(shí)程成像，照相結(jié)果如圖5所示。

從串珠鐮刀菌活體細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)時(shí)程熒光成像結(jié)果中可以直觀(guān)看出，隨著對(duì)試樣培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SiC量子點(diǎn)已標(biāo)記串珠鐮刀菌的熒光強(qiáng)度隨著該菌對(duì)溶液的不斷吸收、SiC量子點(diǎn)逐步滲入菌內(nèi)而逐漸增強(qiáng)，使得在熒光顯微鏡下觀(guān)測(cè)到的該菌的數(shù)目和形態(tài)更加清晰；通過(guò)菌液2(含SiC量子點(diǎn))與菌液1(無(wú)SiC量子點(diǎn))對(duì)比，串珠鐮刀菌的菌落數(shù)量、分裂形態(tài)和發(fā)育機(jī)理等均未出現(xiàn)明顯差異，這表明該熒光標(biāo)記材料幾乎無(wú)細(xì)胞毒性或毒性極小甚至可以忽略，完全不影響該菌的長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，該試驗(yàn)結(jié)果與Sahu等關(guān)于碳化硅量子點(diǎn)細(xì)胞毒性的研究結(jié)果完全一致[13]；同時(shí)，Bluet等研究團(tuán)隊(duì)更為深入的研究并解釋了碳化硅量子點(diǎn)細(xì)胞無(wú)毒的原因，相比經(jīng)表面修飾后的鎘系量子點(diǎn)其表面物理化學(xué)特性簡(jiǎn)單，此外該量子點(diǎn)在對(duì)客體標(biāo)記的過(guò)程中被標(biāo)記客體吸收后以均勻的形式分布于活體細(xì)胞的。碳化硅量子點(diǎn)的無(wú)毒(或低毒)為其今后在活體細(xì)胞、靶向細(xì)胞甚至人體細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程成像奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

3.4 根皮苷環(huán)境下串珠鐮刀菌的數(shù)量及分裂形態(tài)的變化

驗(yàn)證了SiC量子點(diǎn)能夠成功實(shí)現(xiàn)對(duì)串珠鐮刀菌的長(zhǎng)時(shí)程示蹤成像，深入研究串珠鐮刀菌生長(zhǎng)速度及分裂形態(tài)與有無(wú)根皮苷環(huán)境的影響以及有根皮苷但其含量不同影響程度的變化狀況，經(jīng)過(guò)對(duì)同一生長(zhǎng)時(shí)期(培養(yǎng)20 d)的該菌在有、無(wú)根皮苷環(huán)境下試樣(菌液2、菌液3、菌液4)的取樣觀(guān)察對(duì)比，發(fā)現(xiàn)根皮苷環(huán)境下串珠鐮刀菌細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)較大變化，如圖6所示。

圖6a、6b、6c分別為菌液2、菌液3、菌液4三試樣培養(yǎng)15 d時(shí)的熒光成像結(jié)果(放大400倍)。從照相結(jié)果中可以看出，未添加根皮苷的菌液2的串珠鐮刀菌數(shù)目很少，而加入根皮苷的菌液3和菌液4的數(shù)量明顯較多。為了排除觀(guān)察視野的局限性，對(duì)三種試樣在熒光顯微鏡下縮小同樣倍數(shù)(放大200倍)后再次進(jìn)行照相，其結(jié)果如圖6d、6e、6f所示，結(jié)果同樣表明未添加根皮苷的串珠鐮刀菌數(shù)量明顯少于添加了根皮苷的該菌，初步說(shuō)明了根皮苷的添加在一定程度上促進(jìn)了串珠鐮刀菌的生長(zhǎng)。

考察根皮苷環(huán)境對(duì)串珠鐮刀菌數(shù)量影響的同時(shí)又發(fā)現(xiàn)，添加根皮苷的菌液試樣在生長(zhǎng)分裂形態(tài)、強(qiáng)度方面有著更為顯著的特點(diǎn)，圖7即為不同菌液(菌液2、3、4)在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)35 d時(shí)熒光顯微鏡照相結(jié)果。

圖7照相結(jié)果表明，包括初期的分生孢子生長(zhǎng)成串珠菌落，進(jìn)而形成團(tuán)絮狀菌絲這一過(guò)程比起未添加根皮苷的串珠鐮刀菌菌落，其生長(zhǎng)速度要快的多，并且在分裂形態(tài)上同樣有著較大的區(qū)別。這表明無(wú)論是在生長(zhǎng)速度上或是分裂形態(tài)上，根皮苷為該菌提供了一個(gè)助長(zhǎng)的環(huán)境。

將圖6a～c與圖7a～c兩組照相結(jié)果做作對(duì)比，不同的根皮苷含量對(duì)串珠鐮刀菌生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)的影響程度不盡相同，不難發(fā)現(xiàn)，1.0 mol/L根皮苷含量的生長(zhǎng)環(huán)境下串珠鐮刀菌數(shù)量大于、分裂強(qiáng)度高于0.5 mol/L根皮苷含量的試樣。這表明隨著添加根皮苷含量的增加(一定范圍)，串珠鐮刀菌的數(shù)量、分裂強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。

圖6 不同根皮苷含量環(huán)境串珠鐮刀菌的數(shù)量變化(a)無(wú)根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1.0 mol/L;(d)無(wú)根皮苷(較a縮小2倍);(e)0.5 mol/L(較b縮小2倍);(f)1.0 mol/L(較c縮小2倍)Fig.6 Number changes of fusarium moniliforme in different environments with different content of phloretin at thesame culture time (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L ;(c)1 mol/L;(d)no phlorizin (2 times smaller than a);(e)0.5 mol/L (2 times smaller than b);(f)1 mol/L (2 times smaller than c)

圖7 同一培養(yǎng)時(shí)間(35 d)不同根皮苷含量的串珠鐮刀菌分裂程度變化(a)無(wú)根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/LFig.7 Change of fission degree of fusarium moniliforme with different content ofphloretin at the same culture time(35 d) (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/L

3.5 串珠鐮刀菌對(duì)蘋(píng)果幼苗根部侵染過(guò)程

將經(jīng)碳化硅量子點(diǎn)熒光標(biāo)記材料穩(wěn)定標(biāo)記后的串珠鐮刀菌從菌液4(高含量的根皮苷助長(zhǎng)了鐮刀菌的分裂生長(zhǎng)，其吸收的熒光標(biāo)記材料碳化硅量子點(diǎn)的量也相對(duì)較多，便于觀(guān)察該菌對(duì)宿主的侵染過(guò)程)中分離提純，然后將標(biāo)記后的該菌無(wú)菌接種到宿主(蘋(píng)果植株幼苗)生長(zhǎng)的培養(yǎng)液；對(duì)其在恒溫、無(wú)菌條件下長(zhǎng)時(shí)間(約30 d)培養(yǎng)，并于每天對(duì)其取樣觀(guān)察，熒光顯微鏡下觀(guān)察不同時(shí)段(1 d、5 d、10 d、20 d)根部侵染情況并照相其結(jié)果如圖8所示。

對(duì)培養(yǎng)液接種后的蘋(píng)果幼苗培養(yǎng)1 d時(shí)取樣并在熒光顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果如圖8a所示，蘋(píng)果幼苗根毛附近發(fā)出微弱的熒光，這表明串珠鐮刀菌對(duì)幼苗的侵染已初步開(kāi)始；5 d時(shí)，再次取樣觀(guān)察結(jié)果如圖8b所示，蘋(píng)果幼苗根毛區(qū)的熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，這表明根毛已經(jīng)吸收了大量標(biāo)記后的串珠鐮刀菌，并且已鎖定侵染宿主的初始位置為根毛區(qū)；10 d時(shí)后繼續(xù)取樣觀(guān)察結(jié)果如圖8c所示，蘋(píng)果植株幼苗根部的表皮細(xì)胞發(fā)出很強(qiáng)的熒光，這表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根毛吸收的串珠鐮刀菌逐漸被該區(qū)表皮細(xì)胞所攝取；在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到20 d時(shí)，進(jìn)行最后一次取樣，將根須的表皮去除做成切片進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果如圖8d所示，切片在熒光顯微鏡下發(fā)出了劇烈的熒光，這表明串珠鐮刀菌已經(jīng)進(jìn)入到根須的細(xì)胞核，完成了對(duì)宿主的侵染。

圖8 串珠鐮刀菌對(duì)蘋(píng)果幼苗根部侵染過(guò)程的動(dòng)態(tài)示蹤及成像(a)1 d(b)5 d;(c)10 d;(d)20 dFig.8 Dynamic tracing and imaging of the root of apple tree which infected by fusarium moniliforme(a)1 d;(b)5 d;(c)10 d;(d)20 d

圖9 串珠鐮刀菌對(duì)挫傷后蘋(píng)果植株幼苗根須的侵染熒光成像(培養(yǎng)5 d)Fig.9 Fluorescence imaging of the injuredroot of apple tree which infected by fusarium moniliforme(5 d cultivating after marked)

為驗(yàn)證串珠鐮刀菌侵染宿主(蘋(píng)果幼苗植株根部為例)的開(kāi)始位置確實(shí)從根毛區(qū)開(kāi)始，在無(wú)菌條件下將培養(yǎng)1 d的蘋(píng)果幼苗根須人為挫傷后放入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，5 d后將挫傷部分根須取樣后仍制以切片形式在熒光顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果如圖9所示。

圖中被人為挫傷的根須部分為橢圓所圈，而所圈發(fā)亮的部分則為串珠鐮刀菌因被量子點(diǎn)標(biāo)記而在顯微鏡下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，很明顯該位置仍然是幼苗的根毛區(qū)，串珠鐮刀菌并沒(méi)有因?yàn)樗拗鱾诘拇嬖诙紫热肭种链靷课坏谋砥ぜ?xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與A. L. Lagopodi研究的結(jié)果完全一致[15]，因此有理由認(rèn)為：根毛區(qū)是植株新陳代謝和吸收養(yǎng)分的重要部位，所以串珠鐮刀菌對(duì)宿主侵染的初始位置是根毛區(qū)。

4 結(jié) 論

(1)碳化硅量子點(diǎn)成為繼鎘系量子點(diǎn)后又一新型半導(dǎo)體標(biāo)記材料，它不僅可以成功標(biāo)記活體細(xì)胞，而且還能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程成像與動(dòng)態(tài)示蹤，為實(shí)時(shí)對(duì)細(xì)胞、活體內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，揭示生命活動(dòng)規(guī)律提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

(2)串珠鐮刀菌在不同根皮苷含量生長(zhǎng)環(huán)境長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，其數(shù)量、形態(tài)、生理機(jī)能的變化表明根皮苷促進(jìn)了串珠鐮刀菌的生長(zhǎng)，并且隨著生長(zhǎng)環(huán)境中根皮苷含量的增加，該菌的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)更為旺盛；串珠鐮刀菌對(duì)蘋(píng)果幼苗侵染過(guò)程的動(dòng)態(tài)示蹤表明，串珠鐮刀菌對(duì)蘋(píng)果幼苗根部侵染的初始部位是根毛區(qū)。

(3)利用碳化硅量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)，初步研究了在親合狀況下串珠鐮刀菌侵染蘋(píng)果幼苗根部致病過(guò)程的組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)特征，揭示了該菌的致病過(guò)程與機(jī)制，為抗病新品種、新型農(nóng)藥等防治方法的研究提供了理論依據(jù)。