蒙藥材大托葉云實(shí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

牧 丹，蘇日娜，布 仁，白文明，那生桑，趙婷婷

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100)

蒙藥材大托葉云實(shí)(CaesalpiniaecristaeSemen)為豆科植物大托葉云實(shí)(CaesalpiniacristaL.)的干燥成熟種子，蒙語(yǔ)名卓冷-烏熱、占巴來(lái)。本品味辛，性溫，具有祛胃、腎寒、補(bǔ)腎之功效[1-2]。大托葉云實(shí)多生于山溝、路旁或草地，廣泛分布于世界熱帶地區(qū)，我國(guó)主要產(chǎn)于福建、廣東、廣西、湖北、湖南、海南、四川、貴州和臺(tái)灣等地[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前大托葉云實(shí)中含有萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和甾體類(lèi)化合物[4]。其中三萜類(lèi)化合物具有廣泛的藥理作用和生物活性，如免疫作用、抗腫瘤、防治心血管疾病等，還可以用作食品的天然甜味劑、抗氧化劑等[5]。三萜類(lèi)化合物的含量測(cè)定研究已有較多報(bào)道[6-8]。先行蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)大托葉云實(shí)僅有鑒別項(xiàng)的規(guī)定[2-3]，有關(guān)化學(xué)成分和藥理活性方面的研究報(bào)道較少，如2015年劉輔玥等[9]對(duì)大托葉云實(shí)化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，2016年徐晨等[10]采用柱色譜和其他分離方法對(duì)大托葉云實(shí)化學(xué)成分進(jìn)行分離得到29種化合物，并采用MTT法對(duì)其中兩種化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性研究。然而，目前對(duì)于灰分檢查、顯微鑒別以及含量測(cè)定等尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。隨著蒙藥研究與應(yīng)用的迅速發(fā)展，現(xiàn)行方法已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足大托葉云實(shí)的質(zhì)量控制要求。本文以建立蒙藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為目的，對(duì)大托葉云實(shí)的性狀、顯微鑒別與灰分檢查等項(xiàng)目進(jìn)行系統(tǒng)研究，并采用香草醛-高氯酸比色法，建立大托葉云實(shí)中總?cè)祁?lèi)化合物的分光光度含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材

大托葉云實(shí)藥材購(gòu)于全國(guó)各地，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定為豆科植物大托葉云實(shí)CaesalpiniacristaL.的干燥成熟種子。

表1 大托葉云實(shí)藥材信息

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52CS9(上海亞榮生化儀器廠)；KH5200DE型數(shù)控超聲儀(昆山禾創(chuàng)超神儀器有限公司)；SHB-B95T型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；恒溫水浴鍋B-220(上海亞榮生化儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 化學(xué)試劑

對(duì)照品齊墩果酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 110709-201607)；水為Milli-Q超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品呈不規(guī)則圓形，稍扁，直徑1.5～2 cm。表面灰綠色，光滑，微具光澤，具同心性環(huán)紋，一側(cè)平截或淺凹陷，種臍點(diǎn)狀，淺黃白色或淺黃棕色，周?chē)岛稚?。質(zhì)堅(jiān)硬不易破碎，種皮厚約1 mm，斷面紅紫色，內(nèi)皮灰白色，有稍凸起的線紋；子葉扁圓形，表面黃白色，有不規(guī)則的溝槽，質(zhì)堅(jiān)，斷面略平坦；具豆腥氣，味苦。

2.2 顯微鑒別

本品以種子入藥，種皮顯微結(jié)構(gòu)特殊，其特征性具有鑒別意義。

種皮橫切面：表皮細(xì)胞為一列徑向延長(zhǎng)的柵狀細(xì)胞，長(zhǎng)90～200 μm，外被角質(zhì)層，光輝帶位于中部。支持細(xì)胞1列，啞鈴形，長(zhǎng)15～20 μm。厚壁細(xì)胞多層，不規(guī)則，外層3～6列較小，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙常含黃棕色物質(zhì)。維管束外韌型，斷續(xù)排列成環(huán)。色素細(xì)胞多層，棕色，切向延長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)層為多層薄壁細(xì)胞,向內(nèi)細(xì)胞漸小。種皮最內(nèi)層細(xì)胞長(zhǎng)方形，切向延長(zhǎng)。見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

圖1 大托葉云實(shí)種皮橫切片

圖2 大托葉云實(shí)種皮柵欄細(xì)胞層

圖3 大托葉云實(shí)種皮支持細(xì)胞層

圖4 大托葉云實(shí)種皮厚細(xì)胞層

圖5 大托葉云實(shí)種皮維管束

圖6 大托葉云實(shí)種皮營(yíng)養(yǎng)層及最內(nèi)層

2.3 炮制工藝

經(jīng)查閱蒙藥本草及蒙藥早年文獻(xiàn)，未見(jiàn)有關(guān)大托葉云實(shí)的特殊炮制記載。但近代文獻(xiàn)和《蒙藥炮制學(xué)》記載了“取仁”的方法。《蒙藥炮制文獻(xiàn)研究》中記載：“炒微黃或微炒，去種皮，取仁用之?！庇纱送茢?，炒制的目的不在炒制而達(dá)到某功效，而是為去種皮取仁方便，故本文未做炮制工藝研究。經(jīng)簡(jiǎn)單對(duì)比觀察：文火炒燙(約260 ℃)大托葉云實(shí)2～3 min，篩去沙石，去種皮取仁，炮制效果較為理想。

2.4 灰分檢查

按照《中國(guó)藥典》(2015年版通則2302)灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。取供試品2～3 g，置于熾灼至恒重的坩堝中，稱(chēng)定重量，緩緩熾熱，至完全碳化時(shí)逐漸升高溫度至500～600 ℃，使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中總灰分的含量(%)。結(jié)果表明：7批樣品總灰分含量在4.250%～5.389%之間，平均值為4.802%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大托葉云實(shí)灰分含量測(cè)定

2.5 含量測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法《中國(guó)藥典》(2015年版通則0401)對(duì)總?cè)祁?lèi)成分含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 取齊墩果酸5.0 mg，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液制備 取凈砂置鍋，武火加熱(約260 ℃)，投入大托葉云實(shí)，改文火炒至表面顏色加深(2～3 min)，即取出，篩去砂，放涼，剝?nèi)ネ馄?，取仁，研?xì)粉，過(guò)60目篩。取本品粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置于索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙干燥至恒重，移入50 mL具塞三角瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，超聲(功率100 W，溫度25 ℃，頻率40 kHz)提取30 min，濾過(guò)，置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，即為供試品溶液。

2.5.3 待測(cè)溶液制備 取上述對(duì)照品溶液1 mL，供試品溶液取4 mL，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，水浴揮干溶劑；各加新鮮配制的5%香草醛冰乙酸溶液1 mL、高氯酸4 mL，搖勻，閉塞，75 ℃水浴中加熱20 min，取出冷卻，置于25 mL容量瓶中，用冰乙酸定容至刻度，既得待測(cè)溶液。

2.5.4 測(cè)定條件選擇 (1)波長(zhǎng)選擇。將上述待測(cè)溶液制備后放置20 min，用分光光度計(jì)于400～800 nm處進(jìn)行光譜掃描，以不加對(duì)照品的隨行試劑為空白。結(jié)果表明齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液均在548 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選取548 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

(2)5%香草醛冰乙酸溶液用量考察。精密吸取2 mL對(duì)照品溶液5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下待測(cè)溶液制備方法，分別加入0.2 mL、0.6 mL、1 mL、1.4 mL、1.8 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，于548 nm處測(cè)定其吸光度分別為0.245、0.416、0.474、0.459、0.432。結(jié)果表明5%香草醛冰乙酸溶液最佳用量為1 mL。

(3)高氯酸用量考察。精密吸取2 mL對(duì)照品溶液5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下待測(cè)溶液制備方法，分別加入2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL高氯酸溶液，在548 nm處測(cè)定其吸光度為0.408、0.465、0.477、0.463、0.459，結(jié)果表明高氯酸最佳用量為4 mL。

(4)水浴溫度考察。精密吸取2mL對(duì)照品溶液5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下待測(cè)溶液制備方法，分別置于55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，水浴加熱20 min，于548 nm處測(cè)定吸光度分別為0.330、0.391、0.478、0.498、0.535，雖然隨著水浴溫度的升高吸光度隨之上升，但水浴溫度高于75 ℃時(shí)，空白溶液出現(xiàn)顏色變化，故水浴溫度選定為75 ℃。

(5)水浴時(shí)間考察。精密吸取2 mL對(duì)照品溶液5份，按照“2.5.3”項(xiàng)下待測(cè)溶液制備方法，分別加熱10 min、20 min、30 min、40 min、50 min后，于548 nm處測(cè)定吸光度分別為0.367、0.477、0.512、0.578、0.768。雖然隨水浴時(shí)間的增加，吸光度隨之上升，但水浴時(shí)間超出20 min時(shí)，空白溶液出現(xiàn)顏色變化，故水浴時(shí)間選定為20 min。

(6)待測(cè)溶液放置時(shí)間考察。精密量取供試品溶液4 mL，按照“2.5.3”項(xiàng)下待測(cè)溶液制備方法制備后，在60 min內(nèi)每隔5 min測(cè)一次吸光度，結(jié)果表明供試品溶液配制后在20～30 min內(nèi)較穩(wěn)定，30 min后穩(wěn)定性下降。因此用此法測(cè)定需在配制后20～30 min內(nèi)完成。

2.5.5 方法學(xué)考察 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密量取對(duì)照品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、

3.0 mL，分別置于50 mL錐形瓶中，水浴揮干溶劑，各管加入新鮮配制的5%香草醛冰乙酸溶液1 mL、高氯酸4 mL，搖勻，閉塞，75 ℃水浴中加熱20 min，取出，冷卻，移至25 mL量瓶中，用冰乙酸定容，放置20 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)光光度法，在548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為y=54.914x+0.0029，相關(guān)系數(shù)r=0.999，線性范圍為0.004～0.024 mg/mL。見(jiàn)圖7。

圖7 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)精密度試驗(yàn)。取配制好的對(duì)照品溶液，按照本實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算其RSD值為0.4%。結(jié)果表明該方法的精密度良好，符合要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

(3)重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批大托葉云實(shí)樣品粉末

(20161020)6份，精密稱(chēng)定，按上述方法制備供試品溶液并測(cè)定其吸光度。結(jié)果RSD為1.0%，表明儀器重現(xiàn)性良好。見(jiàn)表3。

表3 重現(xiàn)性考察結(jié)果

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一批大托葉云實(shí)供試品溶液(20161020)，分別于放置0、1、2、4、8、12 h后按上述條件測(cè)定其吸光度并記錄。結(jié)果吸光度RSD為0.98%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

(5)加樣回收試驗(yàn)。稱(chēng)取已知總?cè)坪康拇笕~云實(shí)粉末(過(guò)60目篩)6份，精密稱(chēng)定，分別脫脂后，加入對(duì)照品，比例為1∶0.5、1∶1、1∶1.5，繼續(xù)按照制備供試品溶液的方法制備，并在上述條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率為97.14%～100.9%，平均值為98.78%，RSD為1.2%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 含量測(cè)定 7個(gè)不同批次樣品各取3份，精密稱(chēng)定，按上述方法制備供試品溶液，分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算出7個(gè)批次樣品中總?cè)祁?lèi)成分的含量，結(jié)果顯示樣品中總?cè)祁?lèi)成分的含量為0.287%～0.346%。見(jiàn)表6。

表6 大托葉云實(shí)樣品中總?cè)坪繙y(cè)定

續(xù)表6 大托葉云實(shí)樣品中總?cè)坪繙y(cè)定

3 討論

大托葉云實(shí)種皮堅(jiān)硬，難以破開(kāi)，因此本文中所選的炮制工藝為經(jīng)簡(jiǎn)單對(duì)比研究決定的，僅為去種皮取仁方便，而對(duì)待測(cè)組分的含量并無(wú)明顯影響。在選擇樣品提取方法時(shí)，首先比較了超聲提取法和回流提取法，結(jié)果兩種提取方法提取率相差不大，超聲提取法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高。其次，比較了幾種提取溶劑的提取率，結(jié)果本文中所選的乙酸乙酯提取率最高，方法學(xué)更穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)確定了文中所述的提取方法。本文建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行，準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，可用于控制大托葉云實(shí)的內(nèi)在質(zhì)量和用藥品質(zhì)。