鐵皮石斛與其他不同品種石斛HPLC特征圖譜比較研究

宋紅坤，蔣明明，林 濤，劉興勇，王繼良，劉宏程*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南 昆明650205)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)植物，是我國(guó)名貴中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。鐵皮石斛性味甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，具有滋陰清熱、益胃生津之功效[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，鐵皮石斛可用于慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病等癥的治療，具有抗腫瘤、抗衰老等作用[3]。2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)將鐵皮石斛從石斛中分開(kāi)，單列一味，足見(jiàn)其作用特殊。

鐵皮石斛主要分布于浙江、廣西、福建和云南等地。由于鐵皮石斛特殊的生長(zhǎng)環(huán)境和人們的不合理采掘，鐵皮石斛的野生資源已日趨枯竭，鐵皮石斛是目前人工栽培最主要的石斛品種。石斛種類(lèi)繁多，致使鐵皮石斛市場(chǎng)假冒、偽劣等現(xiàn)象嚴(yán)重。雖然 2010 版《中國(guó)藥典》將鐵皮石斛獨(dú)立建立品系，但在市場(chǎng)上還未規(guī)范化。目前鐵皮石斛仍主要以外觀性狀鑒別和以多糖含量為指標(biāo)，這樣的鑒別方法既難以測(cè)定鐵皮石斛有效成分的含量，加工成商品后又難以辨別是否含有鐵皮石斛成分，嚴(yán)重影響了鐵皮石斛的產(chǎn)品質(zhì)量和市場(chǎng)形象。

石斛真?zhèn)舞b別及質(zhì)量受到重視，各種鑒別技術(shù)也在不斷發(fā)展。石斛鑒別常用方法有傳統(tǒng)顯微鑒定、化學(xué)指紋圖譜、DNA指紋圖譜等[4]，HPLC指紋圖譜適用普遍，作為化學(xué)指紋圖譜是中草藥領(lǐng)域質(zhì)量評(píng)價(jià)公認(rèn)方法，其作為樣本自身的化學(xué)條碼側(cè)重于對(duì)品質(zhì)的鑒定，反映的化學(xué)成分信息既有種內(nèi)的共性，又因種類(lèi)不同而具有差異性。因此，化學(xué)指紋圖譜兼具了表征屬性識(shí)別和質(zhì)量控制技術(shù)，能為石斛真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供強(qiáng)有力的手段。

目前，基于色譜指紋圖譜的石斛鑒別研究主要是建立一種待鑒別石斛的指紋圖譜，再以該指紋圖譜和其他種類(lèi)石斛圖譜比較，該方法針對(duì)性強(qiáng)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC技術(shù)，采用全輪廓指紋圖譜方法進(jìn)行了鐵皮石斛HPLC特征圖譜的研究，并對(duì)其他七個(gè)品種石斛(流蘇、球花、紫皮、金釵、鼓槌、苞鞘、兜唇)進(jìn)行特征圖譜的比較研究，以期對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及市場(chǎng)的規(guī)范化提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(四元梯度洗脫系統(tǒng)，配備2998紫外檢測(cè)器、Empower 3操作軟件，美國(guó)Waters公司)；AB204-N型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500-E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

采集鐵皮石斛，編號(hào)為S1～S13，其中5批鮮品鐵皮石斛(S1、S2、S3、S4、S5)、1批鮮品硬角鐵皮石斛(S10)、2批鮮品鐵皮石斛雜交種(S11、S12)、1批干品鐵皮楓斗(S13)采自云南省德宏州石斛種質(zhì)資源庫(kù)，1批鮮品鐵皮石斛(S6)采自云南廣南，1批鮮品鐵皮石斛(S7)采自浙江，1批鮮品鐵皮石斛采自霍山(S8)，1批鮮品鐵皮石斛(S9)采自串朋；其他7種石斛鮮品各1批采自云南省德宏州石斛種質(zhì)資源庫(kù)。取上述收集的鮮品石斛藥材莖，將其剪碎后，在60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱下烘干，打粉，過(guò)60目篩，備用；干品石斛藥材，打粉，過(guò)60目篩，備用。所有石斛藥材經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所劉宏程研究員鑒定確認(rèn)。11種對(duì)照品：對(duì)羥基苯甲酸、香草酸(批號(hào)分別為20161208、20171215，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、丁香酸、阿魏酸(批號(hào)分別為201801291、201801161，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)、東莨菪內(nèi)酯、石斛酚(批號(hào)分別為110768-200504、111875-201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、濱蒿內(nèi)脂、柚皮素(批號(hào)分別為R21A9F59551、518co21，北京索萊寶科技有限公司)、香豆素(批號(hào)LD20R25，北京百靈威科技有限公司)、芹菜素(批號(hào)171019，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)、毛蘭素為實(shí)驗(yàn)室自制(純度均>98.0%)；乙腈甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司)；冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；娃哈哈礦泉水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵皮石斛HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK MG ⅡC18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以體積分?jǐn)?shù)為0.2%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫：0～35 min為5%A→32%A，35～57 min為32%A→65%A，57～60 min為65%A→5%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別取11種對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于10 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至10 mL，搖勻，制成混標(biāo)溶液備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取石斛粉末2.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗(yàn)。精密吸取同一批次鐵皮石斛供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值進(jìn)行考察，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3%，符合指紋圖譜分析要求。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一批次鐵皮石斛供試品溶液10 μL，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣分析，考察主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，其RSD均<3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批鐵皮石斛樣品6份，分別制備供試品溶液，精密吸取鐵皮石斛各供試品溶液10 μL進(jìn)樣分析?？疾熘饕V峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，其RSD均<3%，指紋圖譜的全貌無(wú)明顯變化，符合指紋圖譜要求。

2.1.5 樣品檢測(cè) 精密吸取鐵皮石斛供試品溶液10 μL，按色譜條件進(jìn)樣分析。

2.1.6 特征圖譜的建立與分析 (1)相似度分析。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)》，以平均數(shù)法生成特征圖譜共有模式，計(jì)算S1～S13與共有模式的相似度分別為0.924、0.807、0.881、0.927、0.886、0.919、0.841、0.926、0.941、0.791、0.903、0.882、0.929。見(jiàn)圖1。

圖1 13批鐵皮石斛HPLC特征圖譜重疊

(2)色譜峰的標(biāo)定。根據(jù)13批鐵皮石斛供試品溶液的測(cè)定結(jié)果，共標(biāo)示出55個(gè)特征共有峰，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)出11個(gè)峰，分別是16號(hào)峰對(duì)羥基苯甲酸，19號(hào)峰香草酸，21號(hào)峰丁香酸，31號(hào)峰東莨菪內(nèi)脂，32號(hào)峰阿魏酸，39號(hào)峰濱蒿內(nèi)酯，40號(hào)峰香豆素，48號(hào)峰柚皮素，49號(hào)峰芹菜素，52號(hào)峰石斛酚，55號(hào)峰毛蘭素。見(jiàn)圖2。

圖2 13批鐵皮石斛HPLC特征圖譜共有模式

2.2 鐵皮石斛與其他8個(gè)品種石斛HPLC特征圖譜比較

2.2.1 樣品檢測(cè) 按照鐵皮石斛HPLC特征圖譜建立的色譜條件和供試品溶液制備方法，分別精密吸取8個(gè)品種石斛供試品溶液10 μL，按色譜條件進(jìn)樣分析。

2.2.2 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)》，以鐵皮石斛為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算鐵皮石斛與流蘇石斛、球花石斛、紫皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛的相似度分別為0.252、0.464、0.875、0.354、0.338、0.169、0.794。見(jiàn)圖3。

圖3 8種石斛HPLC特征圖譜比較

色譜峰的標(biāo)定：將11種對(duì)照品混標(biāo)溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣，對(duì)比相對(duì)保留時(shí)間可知，1號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸，2號(hào)峰為香草酸，3號(hào)峰為丁香酸，4號(hào)峰為東莨菪內(nèi)脂，5號(hào)峰為阿魏酸，6號(hào)峰為濱蒿內(nèi)脂，7號(hào)峰香豆素，8號(hào)峰柚皮素，9號(hào)峰芹菜素，10號(hào)峰石斛酚，11號(hào)峰毛蘭素。11種成分在不同品種石斛中的檢識(shí)情況。見(jiàn)表1。

8種石斛HPLC主要峰群比較分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同石斛品種之間化學(xué)成分和含量有較大差異。石斛的HPLC圖譜主要由4組色譜峰組成，如圖3所示。第1組峰，保留時(shí)間tR<14 min，該組峰特征性不強(qiáng)；第2組峰，14 min

表1 11種成分在8種石斛中的檢識(shí)結(jié)果

注：“-”表示在該批藥材中未檢出。

3 討論

目前可加工為石斛楓斗的原植物來(lái)源廣泛，市場(chǎng)上甚至把一些歷來(lái)不作藥用的石斛屬及非石斛屬植物也加工冒充鐵皮石斛楓斗，造成了石斛市場(chǎng)混亂的現(xiàn)狀。

本研究通過(guò)對(duì)13批鐵皮石斛的特征圖譜分析，共標(biāo)定了55個(gè)特征峰，13批樣品的相似度為0.791～0.929。其中樣品S10的相似度為0.791，較其他批次的相似度低。本研究也將鐵皮石斛和流蘇石斛、球花石斛、紫皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、兜唇石斛、苞鞘石斛進(jìn)行了HPLC特征圖譜的比較，發(fā)現(xiàn)只有紫皮石斛、苞鞘石斛和鐵皮石斛的相似度較高，其相似度分別為0.875、0.794，其他5個(gè)品種石斛和鐵皮石斛的相似度較低，并且5個(gè)品種石斛之間的相似度也比較低。說(shuō)明該指紋圖譜可以作為鐵皮石斛鑒別的參考依據(jù)，在此研究基礎(chǔ)上可以將鐵皮石斛、紫皮石斛、苞鞘石斛作進(jìn)一步的藥效學(xué)研究，為尋找鐵皮石斛的替代品提供參考依據(jù)。此外，8個(gè)品種石斛主要色譜峰的數(shù)目、峰形等都存在較大差異，說(shuō)明8個(gè)品種石斛所含化學(xué)成分存在較大差異，可以為尋找新石斛類(lèi)藥材來(lái)源提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由于藥材化學(xué)成分受生長(zhǎng)年限、生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間等影響較大，本次試驗(yàn)所收集的樣品有限，故不能完全代表藥材中所含成分含量，還需收集多批次樣品進(jìn)行深入的研究。

本研究所建立的HPLC全輪廓指紋圖譜信息豐富，但對(duì)強(qiáng)揮發(fā)性而未有很好紫外吸收的物質(zhì)，是DAD檢測(cè)器的一個(gè)盲區(qū)，需串聯(lián)MS等檢測(cè)器進(jìn)行補(bǔ)充和完善。樣品共有峰和相似度對(duì)評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的共性有重要價(jià)值，但不同品種指紋圖譜相互間的差異也有重要意義，可采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析、多重方差分析及主成分分析等，為石斛的系統(tǒng)研究提供可靠依據(jù)[7]。