滬浙地區(qū)不同泌乳期母乳脂肪酸組成及分布研究

何光華 李歸浦 周 兵 肖海龍 儲小軍 葉興乾

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 貝因美嬰童食品股份有限公司 杭州310053 3 貝因美（杭州）食品研究院有限公司 杭州311106 4 杭州市食品藥品檢驗研究院 杭州310022）

母乳是嬰兒的最佳主食，它富含多種人體必需脂肪酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、低聚糖和免疫物質(zhì)等，與牛乳、羊乳等相比，不但營養(yǎng)均衡，而且更有利于嬰兒的消化、吸收和利用，然而很大一部分嬰兒由于某些特殊原因無法進行正常的母乳喂養(yǎng)，這時作為母乳替代品的嬰兒配方乳粉就成為一種比較理想的選擇。對于嬰兒配方乳粉而言，母乳是黃金標(biāo)準(zhǔn)，母乳化是終極目標(biāo)，故首要的工作是母乳研究。脂肪作為母乳的重要組成部分，一直以來都是母乳研究的熱點之一。早在20 世紀(jì)60年代，國外就開始著手對母乳脂肪的研究，到目前為止，不僅廣泛而深入地研究了不同地區(qū)、 不同泌乳期母乳的總脂肪酸組成[1-4]，而且還于近年來重點研究了母乳脂肪的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括甘油三酯和磷脂結(jié)構(gòu)的脂肪酸組成及位置分布[5-6]，為嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究奠定了基礎(chǔ)。與國外相比，國內(nèi)對母乳脂肪的研究起步較晚 （始于20 世紀(jì)90年代），雖然也有一些報道[7-10]，但這些研究均只注重對母乳總脂肪酸組成的分析，而很少涉及對母乳脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，嚴(yán)重影響了我國嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化，特別是脂質(zhì)結(jié)構(gòu)母乳化的研究進程。

本文以我國滬浙地區(qū)乳母為對象，比較研究了不同泌乳期（0～1，1～3，3～6，6～12月）母乳的總脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸組成，并著重對脂肪酸在母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)上的位置分布特點進行分析，為我國嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母乳：取自滬浙地區(qū)不同泌乳期乳母。

試劑：甲醇、正己烷、甲酸、氯仿等色譜純試劑，乙醇、乙醚、石油醚、丙酮、氨水、三氟化硼/乙醚溶液等分析純試劑，37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品，美國Nu-Chek 公司；胰蛋白酶，美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 試驗儀器

7890A 型氣相色譜儀 （帶FID 檢測器和Supeclo 2560 型色譜柱），美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 母乳樣本采集 采集對象：母乳樣本采集對象為上海和浙江地區(qū)0～1，1～3，3～6，6～12月泌乳期乳母，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康、足月、初產(chǎn)、單胎；（2）采用母乳喂養(yǎng)；（3）無抽煙、飲酒等不良生活習(xí)慣；（4）無貧血等嚴(yán)重營養(yǎng)性疾病及惡性消耗性疾??；（5）無糖尿病、高血壓等慢性疾病；（6）近期無服用營養(yǎng)補充劑等；共征集乳母230 例，其中0～1月泌乳期乳母45 例，1～3月75 例，3～6月64例，6～12月46 例。

采集方法：所有母乳樣本均采用自動吸乳器單側(cè)乳房收集，收集時間為早上9：00～12：00，收集量為20 mL 以上。收集到的母乳樣本立即分裝到5 個5 mL 凍存管中，然后放至-80 ℃低溫冰箱中以備脂肪酸檢測分析。

1.3.2 母乳脂肪酸檢測分析 母乳脂肪提?。翰捎冒彼?乙醇提取法，具體步驟見GB5413.27-2010 第二法脂肪提取部分。

母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸制備：稱取母乳脂肪20 mg 于10 mL 試管中，加入2 mL 1 mol/L Tris-HCL 緩沖液，0.2 mL 2.2%氯化鈣水溶液，0.5 mL 1 g/L 膽酸鈉水溶液，混合均勻，在40 ℃下水浴1 min，再加入胰脂肪酶20 mg，混勻后繼續(xù)水浴3 min，冷卻并添加6 mol/L HCL 溶液1 mL 和2 mL 乙醚，混勻，4 000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液45 ℃下氮氣吹干，加入1 mL 正己烷溶解，得酶解產(chǎn)物。依次用5 mL 丙酮和正己烷活化氨基柱（500 mg/6 mL），將酶解產(chǎn)物上樣，用丙酮∶正己烷=15 ∶85（體積比）5 mL 淋洗，丙酮：正己烷=50 ∶50（體積比）5 mL 洗脫，收集洗脫液，45 ℃下氮氣吹干，得甘油三酯sn-2 位脂肪酸備用。

母乳磷脂脂肪酸制備：稱取母乳脂肪100 mg，加入100 μL 氯仿/甲醇溶液溶解，點樣于薄層板，并在展開缸中采用脂類展開劑：石油醚/乙醚/甲酸=85 ∶15 ∶2（體積比）展開。展開后風(fēng)干，刮下磷脂層于試管中，加入5 mL 氯仿/甲醇溶液溶解，渦 旋2 min，超 聲5 min 后，2 100 r/min 離 心5 min。取上清液45 ℃下氮氣吹干，得磷脂脂肪酸備用。

母乳脂肪酸甲酯化：分別取制備得到的母乳總脂肪酸、 甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸，加入0.7 mL 1 mol/L 的氫氧化鉀/甲醇溶液，混勻，置于60 ℃水浴中振蕩3 min，待冷卻至室溫，加入1 mL 14%的三氟化硼/乙醚溶液，混勻，置于50 ℃烘箱中反應(yīng)15 min，待冷卻至室溫，加入2 mL 飽和NaCl 溶液和1 mL 正己烷，混勻，4 000 r/min 離心5 min，取上清液進氣相色譜檢測。

母乳脂肪酸氣相色譜檢測：脂肪酸的分離檢測采用氣相色譜法，檢測條件為色譜柱：Supeclo 2560（100 m×0.25 mm×0.20 μm），進樣口溫度：240℃，分流比：10 ∶1，進樣量：1 μL，程序升溫：初始溫度60 ℃（保持2 min），以15 ℃/min 升至100 ℃，再以3 ℃/min 升至230 ℃（保持18 min），載氣（N2）流速：1.0 mL/min；檢測器溫度：250℃；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min。

母乳脂肪酸定性與定量分析：脂肪酸的定性通過與脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相圖譜比較得出，脂肪酸的定量采用面積歸一法得出。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用單因素方差分析 （ANOVA）方法得出，所用統(tǒng)計都在SPSS16.0 軟件中實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同泌乳期母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸組成

不同泌乳期母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2位脂肪酸組成分別見表1和2，從表中可以看出，中鏈飽和脂肪酸（MCSFA）、飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）在母乳總脂肪酸中的含量分別為7.45%～10.45%、34.42%～36.79%、35.91%～41.22%、23.63%～27.56%，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的含量分別為10.13%～14.47%、64.99%～66.10%、22.80%～23.78%、10.19%～10.65%。不管是母乳總脂肪酸還是甘油三酯sn-2 位脂肪酸，C12：0、C14：0和C16：0、C18：0均是最主要的MCSFA 和SFA，C18：1n-9是含量最高的MUFA，而n-6 PUFA 和n-3 PUFA均主要由C18：2n-6（LA）、C20：4n-6（ARA） 和C18：3n-3（ALA）、C22：6n-3（DHA）組成。在母乳總脂肪酸中，n-6/n-3、LA/ALA、ARA/DHA 的比例分別為10.56～15.59、12.71～20.38、1.21～1.63，而在母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸中的比例分別為5.13～9.61、12.02～25.91、1.29～1.44。

就母乳總脂肪酸組成而言，隨著泌乳期的延長，C12：0、C14：0和MCSFA含量呈逐漸升高的趨勢，C18：1n-9、MUFA、ARA 和DHA 含量呈先顯著降低而后趨于相對穩(wěn)定的趨勢，LA、ALA、PUFA、n-6 PUFA 和n-3 PUFA 含量呈先逐漸升高而后降低的趨勢，n-6/n-3 和LA/ALA 比例呈先保持穩(wěn)定而后顯著升高的趨勢，而C16：0、C18：0和SFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均沒有顯著性差異。就母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成而言，隨著泌乳期的延長，C12：0、C14：0、MCSFA、LA 以及n-6/n-3、LA/ALA 比例呈逐漸升高的趨勢，ALA、ARA、DHA、n-3 PUFA 含量呈先顯著降低而后趨于相對穩(wěn)定的趨勢，而C16：0、C18：0、SFA、C18：1n-9、MUFA、PUFA、n-6 PUFA 含量以及ARA/DHA 比例在不同泌乳期母乳中均沒有顯著性差異。

表1 不同泌乳期母乳總脂肪酸組成比較（%）Table1 Comparison of fatty acid composition in total lipids of breast milk during different lactation periods （%）

（續(xù)表1）

表2 不同泌乳期母乳甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成比較（%）Table2 Comparison of fatty acid composition in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods （%）

（續(xù)表2）

2.2 不同泌乳期母乳脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布

鑒于母乳中98%以上的脂肪是以甘油三酯形式存在[11-12]，因此母乳總脂肪酸組成可以近似作為甘油三酯總脂肪酸組成。本研究基于上述前提，以母乳總脂肪酸和甘油三酯sn-2 位脂肪酸組成為基礎(chǔ)，通過公式[12]：

得出了不同泌乳期母乳各主要脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布，具體見圖1和圖2。從圖1中可以看出，結(jié)合在母乳甘油三酯sn-2 位上的MCSFA 和SFA 占比分別高達44.5%～46.2%和59.7%～62.9%，而MUFA 和PUFA 占比卻只有19.2%～21.4%和12.6%～14.9%。具體到幾種最主要的脂肪酸單體（圖2），結(jié)合在母乳甘油三酯sn-2 位 上 的C12：0、C16：0、ARA 和DHA 占 比 分 別 達 到51.1%～64.9% 、71.3%～75.6% 、51.2%～53.9% 和56.6%～57.7%，而C18：1n-9、LA 和ALA 占比卻只有18.5%～20.5%、10.5%～11.6%、8.1%～15.1%。除了C12：0和ALA 以外，大部分主要脂肪酸包括MCSFA、SFA、MUFA、PUFA、C16：0、C18：1n-9、LA、ARA 和DHA 在母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布相對穩(wěn)定，其結(jié)合在sn-2 位上的占比隨泌乳期的延長幾乎沒有變化。

2.3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成

不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成見表3，從表中可以看出，MCSFA、SFA、MUFA 和PUFA 的含量分別為8.61%～14.61%、78.13%～82.44%、7.09%～9.14%、9.98%～13.45%，n-6/n-3 的比例為4.97～8.60。隨著泌乳期的延長，C12：0、C14：0、MCSFA、LA、ALA 含量以及n-6/n-3 比例呈逐漸升高的趨勢，C16：0和SFA 含量呈先穩(wěn)定而后顯著下降的趨勢，PUFA 和n-6 PUFA 含量呈先穩(wěn)定而后顯著升高的趨勢，n-3 PUFA、ARA 和DHA 含量呈先顯著降低而后趨于相對穩(wěn)定的趨勢，而C18：0、C18：1n-9和MUFA 含量在不同泌乳期母乳中均沒有顯著性差異。

圖1 不同泌乳期母乳中各類脂肪酸結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.1 The ratios of MCSFA，SFA，MUFA and PUFA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

圖2 不同泌乳期母乳中各種主要脂肪酸結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上的占比Fig.2 The ratios of C12：0，C16：0，C18：1n-9，LA，ALA，ARA and DHA esterified in triglyceride sn-2 position of breast milk during different lactation periods

表3 不同泌乳期母乳磷脂脂肪酸組成比較（%）Table3 Comparison of fatty acid composition in phospholipids of breast milk during different lactation periods （%）

3 討論

截至目前，盡管國內(nèi)也有一些針對不同泌乳期母乳脂肪酸組成的研究報道，但是這些報道所涉及的母乳樣本泌乳期大多在6 個月之內(nèi)[8-10]，難以為不同階段（0～6月和6～12月）嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究提供足夠的數(shù)據(jù)支撐。相比之下，本研究所采集的母乳樣本同時包含了0～1，1～3，3～6，6～12月，4 個不同的泌乳期，因此更有利于直接指導(dǎo)不同階段嬰兒配方乳粉的脂質(zhì)母乳化研究。

就母乳總脂肪酸組成而言，與歐美國家相比，本研究母乳中的PUFA、LA、ALA、ARA 和DHA 含量明顯較高，而MCSFA 和SFA 含量相對較低[2，13-14]；與日本、馬來西亞等沿海島國相比，本研究母乳中的ARA 和DHA 含量相對較低[6，15]。這可能與乳母的飲食習(xí)慣不同相關(guān)，歐美國家乳母的日常飲食以富含MCSFA 和SFA 的動物性食品為主，我國乳母的脂肪酸攝入主要來源于烹飪食物用的各種富含LA 和ALA 的植物油，而日本、馬來西亞等沿海島國乳母日常飲食中攝入了更多富含ARA 和DHA 的海產(chǎn)品。盡管不同國家母乳的總脂肪酸組成有所差異，但是大部分主要脂肪酸隨泌乳期延長的變化趨勢基本相似：MCSFA、C12：0和C14：0含量逐漸升高，LA、ALA 和PUFA 含量先升高后下降，ARA 和DHA 含量先顯著下降而后趨于穩(wěn)定，而SFA、C16：0和C18：0含量幾乎沒有變化。這種相似的變化趨勢主要與乳母以及嬰兒在不同時期的生理特點和需求相關(guān)[9-10，16]。

除了母乳總脂肪組成以外，母乳脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)上的位置分布也一直是備受科學(xué)界關(guān)注的熱點之一。近年來，國外學(xué)者對此進行了重點研究，相比之下，國內(nèi)在這方面的研究很少。本研究顯示，滬浙地區(qū)母乳脂肪中MCSFA、SFA、C12：0、C16：0、ARA 和DHA主要結(jié)合在甘油三酯sn-2 位上，而MUFA、C18：1n-9、PUFA、LA 和ALA 主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且?guī)缀醪浑S泌乳期的變化而變化，其結(jié)果與國外母乳基本相似[5，17-18]。母乳這種相對穩(wěn)定的特殊甘油三酯結(jié)構(gòu)非常有利于嬰兒對脂肪酸、 礦物質(zhì)以及脂溶性維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[12]。研究表明，甘油三酯進入嬰兒體內(nèi)后，首先必須經(jīng)過體內(nèi)胰脂酶的水解，水解產(chǎn)物分別是sn-2 位單甘酯和sn-1，3 位游離脂肪酸，其中sn-2 位單甘酯容易與膽汁酸形成乳糜微粒而直接被腸黏膜吸收，sn-1，3 位游離脂肪酸中，不飽和脂肪酸也能被機體吸收，而飽和脂肪酸特別是長鏈飽和脂肪酸如C16：0和C18：0，容易與鈣和鎂等礦物質(zhì)形成不溶性的皂化物而無法被機體吸收，這不僅會造成飽和脂脂肪酸和鈣、鎂的流失，同時還會使嬰兒產(chǎn)生便秘問題[19-20]。另有研究顯示，與脂肪酸隨機分布的甘油三酯相比，DHA 和ARA 主要結(jié)合在sn-2 位上的特殊甘油三酯更有利于機體對DHA 和ARA 的吸收利用[21]。

磷脂作為母乳脂肪中的第二大類脂質(zhì)，雖然只占母乳總脂肪的1.0%～1.5%，但卻是嬰兒生長發(fā)育所必需的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)。脂肪酸特別是長鏈多不飽和脂肪酸（DHA 和ARA）在母乳磷脂中的含量與嬰兒大腦和視力的快速發(fā)育直接相關(guān)。然而，截至目前，國外關(guān)于母乳磷脂脂肪酸組成的研究很少，而國內(nèi)幾乎是空白。本研究顯示，母乳磷脂脂肪酸中的ARA 和DHA 含量分別為0.70%～1.19%、0.82%～1.41%，盡管不同泌乳期之間有所差異，但均顯著高于其在母乳總脂肪酸中的含量（0.54%～0.80%、0.38%～0.62%），結(jié)果與國外母乳相似[6，14]，這種脂質(zhì)脂肪酸組成模式更有利于促進嬰兒大腦和視力的快速發(fā)育。已有研究表明，結(jié)合在磷脂上的DHA 和ARA 比結(jié)合在甘油三酯上的更容易被嬰兒吸收和利用[21]。

4 結(jié)論

通過對我國滬浙地區(qū)不同泌乳期母乳總脂肪酸、甘油三酯sn-2 位脂肪酸和磷脂脂肪酸的組成及分布研究，得出：（1）除飽和脂肪酸（不包括中鏈）以外，母乳中大部分主要脂肪酸的含量均隨泌乳期的變化而變化，且變化趨勢與國內(nèi)外其它母乳研究結(jié)果基本相似；（2）母乳脂肪酸中，大部分飽和脂肪酸（包括中鏈）主要結(jié)合在甘油三酯sn-2位上，而不飽和脂肪酸（ARA 和DHA 除外）主要分布在甘油三酯sn-1，3 位上，且分布比例相對穩(wěn)定，幾乎不隨泌乳期的延長而變化；（3）不管泌乳期如何變化，母乳磷脂脂肪酸中的DHA 和ARA含量始終顯著高于其在母乳總脂肪酸中的含量；（4） 鑒于母乳脂肪酸在甘油三酯和磷脂結(jié)構(gòu)中的特殊分布，嬰兒配方乳粉脂質(zhì)母乳化研究不僅要關(guān)注對母乳總脂肪酸組成的模擬，更應(yīng)該注重對母乳甘油三酯結(jié)構(gòu)脂肪酸分布以及磷脂脂肪酸組成的模擬。