金屬離子對(duì)微生物蛋白酶活性的影響及機(jī)理

余 茜 張國麗 敖曉琳

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 四川雅安625000）

微生物蛋白酶作為工業(yè)上主要的蛋白酶制劑來源，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物工業(yè)等方面。目前，關(guān)于微生物蛋白酶的相關(guān)研究主要集中在高產(chǎn)菌株的選育，基因結(jié)構(gòu)及功能方面，對(duì)于金屬離子影響微生物蛋白酶活性及其機(jī)理的研究較少。相關(guān)報(bào)道表明添加一定量的金屬離子可以顯著提高蛋白酶活性。這一研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于微生物蛋白酶制劑的生產(chǎn)及相關(guān)發(fā)酵食品工業(yè)進(jìn)步具有重大意義。

1 微生物蛋白酶主要概述

蛋白酶是一類能催化分解蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂產(chǎn)生氨基酸、多肽或者肽段的酶的總稱。根據(jù)反應(yīng)最適pH 可將蛋白酶分為酸性、 中性和堿性蛋白酶。

蛋白酶分布廣泛，其來源可分為動(dòng)物、植物和微生物3 個(gè)方面。動(dòng)、植物蛋白酶主要存在生產(chǎn)周期長，成本高，提取工藝較復(fù)雜和蛋白酶得率較低等問題。因此，從動(dòng)、植物中生產(chǎn)蛋白酶已逐漸被微生物替代。微生物蛋白酶主要來源于真菌、細(xì)菌和病毒，其中真菌以霉菌屬（Aspergillus）為主，細(xì)菌以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，病毒主要有脊髓灰質(zhì)炎病毒和T4噬菌體，用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物蛋白酶主要來自真菌和細(xì)菌（表1）。

蛋白酶是一種重要的工業(yè)酶，據(jù)統(tǒng)計(jì)蛋白酶的銷售占全球總酶銷售量60%左右[1]。其中70%的工業(yè)蛋白酶用于食品發(fā)酵、皮革加工、清潔劑、明膠產(chǎn)業(yè)等[2]。其中，酸性蛋白酶主要用于調(diào)味品及傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)[3-4]，如在干酪制作過程中酸性蛋白酶催化酪蛋白沉淀這一關(guān)鍵步驟常常作為干酪品質(zhì)好壞的指標(biāo)之一；中性蛋白酶主要用于醬油脫苦[5]、啤酒釀造[6]方面，如在醬油發(fā)酵過程，中性蛋白酶可以有效地水解蛋白質(zhì)原料，利用中性蛋白酶修飾作用去除水解產(chǎn)物的苦味；堿性蛋白酶主要用于皮革加工、食品烘焙、肉類軟化等方面[7]，如在面包制作過程中加入一定量的堿性蛋白酶能夠有效提高面團(tuán)的延伸性和韌性，增強(qiáng)面包起泡性[8]。

2 金屬離子作用微生物蛋白酶相關(guān)研究

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)添加少量的金屬離子對(duì)于蛋白酶活性有顯著提高，其中以二價(jià)金屬離子為主。并且在不同來源蛋白酶樣品中添加同種金屬離子其作用效果與蛋白酶最適pH 及其活性部位結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，根據(jù)最佳pH 與活性位點(diǎn)的差異微生物蛋白酶被分為天冬氨酰基蛋白酶 （酸性）、金屬蛋白酶（中性）、半胱氨酸或巰基蛋白酶（堿性）和絲氨酸蛋白酶（堿性）。根據(jù)近幾年國內(nèi)外關(guān)于金屬離子作用微生物蛋白酶的相關(guān)研究結(jié)果表明：部分金屬離子對(duì)微生物蛋白酶具有明顯的激活作用，同種金屬離子對(duì)于不同來源的蛋白酶作用效果不同，不同添加量的作用效果也具有明顯差異。

表1 微生物蛋白酶主要來源Table1 Production strain of microbial protease

2.1 金屬離子對(duì)微生物酸性蛋白酶的影響及機(jī)理研究

微生物酸性蛋白酶主要來源于曲霉屬，其最適反應(yīng)pH 值主要在2.0～4.0。微生物酸性蛋白酶的活性位點(diǎn)一般為天冬氨?；谒械牡鞍酌钢刑於彼嵝偷鞍酌傅姆磻?yīng)機(jī)制最為含糊不清，且沒有簡(jiǎn)單的化學(xué)模式作為指導(dǎo)，然而可以確定的是天冬氨酸型蛋白酶的催化活性與兩個(gè)天冬氨酸殘基有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，部分金屬離子能與酸性蛋白酶活性位點(diǎn)的殘基發(fā)生反應(yīng)從而改變酸性蛋白酶活性。表2歸納了國內(nèi)、外近6年關(guān)于金屬離子作用微生物酸性蛋白酶的研究，包括酸性蛋白酶的來源、最適pH 值、金屬離子添加量及其作用效果等內(nèi)容。

2.1.1 金屬離子激活酸性蛋白酶機(jī)理研究 從表2可以看出Cu2+、Mn2+和Fe2+對(duì)酸性蛋白酶活性影響最為顯著，在大部分研究中Mn2+對(duì)于酸性蛋白酶主要表現(xiàn)為激活作用，Lee 等[14]的研究中添加1 mmol/L 的Mn2+使米曲霉LK-101 的酸性蛋白酶相對(duì)酶活高達(dá)197%，添加1 mmol/L 的Cu2+后酸性蛋白酶相對(duì)酶活達(dá)到184%。Yin 等[11]的研究中添加10 mmol/L 的Fe2+后，酸性蛋白酶相對(duì)酶活高達(dá)225%。從作用機(jī)理來看，Mn2+提高酸性蛋白酶活性的機(jī)理主要是Mn2+參與了酸性蛋白酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，防止其在催化反應(yīng)過程中構(gòu)象的變化，從而提高了反應(yīng)速率，所以Mn2+常常作為酸性蛋白酶的穩(wěn)定劑[15]。Cu2+激活酸性蛋白酶活性的機(jī)理研究主要在于Cu2+可以和酸性蛋白酶活性中心的天冬氨酸殘基發(fā)生復(fù)雜的配體磷酸化反應(yīng)，從而改變酸性蛋白酶的構(gòu)象，天冬氨酸蛋白酶具有極其復(fù)雜的催化機(jī)制，這種通過變構(gòu)而提高酶活的發(fā)現(xiàn)在Ida 等[16]和Karsten[17]的研究中得到了驗(yàn)證。在很多研究報(bào)道中證明一定濃度的Fe2+對(duì)于酸性蛋白酶具有刺激作用，而作用機(jī)理尚不明確。王習(xí)文等[18]在金屬離子對(duì)漆酶活性影響的相關(guān)研究中提及添加一定濃度的Fe2+能夠提高漆酶活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Fe2+主要是通過與底物催化氧化產(chǎn)物ABTS·的反應(yīng)來影響漆酶的活性，這一研究結(jié)果給Fe2+激活蛋白酶活性提供了一定的啟示。然而，F(xiàn)e2+對(duì)于不同菌株所產(chǎn)酸性蛋白酶作用效果不一致，比如在表2中方春玉[12]和張秀春[13]的研究結(jié)果表明Fe2+對(duì)酸性蛋白酶起抑制作用。

表2 金屬離子作用微生物酸性蛋白酶研究Table2 Study on the effect of metal ions on microbial acid protease

2.1.2 金屬離子抑制酸性蛋白酶機(jī)理研究 大部分重金屬離子如Ag+、Hg2+和Fe3+等對(duì)酸性蛋白酶活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。Sawada 等[19]對(duì)金屬離子作用擬青霉酸性蛋白酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明Hg2+對(duì)酸性蛋白酶活性高度抑制。關(guān)于金屬離子抑制酸性蛋白酶活性的機(jī)理在曹志云等[20]的研究中獲得解釋，金屬離子如Cd2+、Pb2+及Hg2+能與酸性蛋白酶中的功能蛋白質(zhì)結(jié)合，占據(jù)酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白酶失活；除占據(jù)酶的活性位點(diǎn)，其抑制機(jī)理可能還與金屬離子結(jié)合酶的活性基團(tuán)有關(guān)。

2.2 金屬離子對(duì)微生物中性蛋白酶的影響及機(jī)理研究

微生物中性蛋白酶一般來源于曲霉屬和芽孢桿菌屬，其最適反應(yīng)pH 值主要在6.5～7.5。微生物中性蛋白酶大部分屬于金屬蛋白酶，其中主要為活性部位含鋅的蛋白酶，還有一些是含有兩種金屬離子的蛋白酶。金屬離子與3 個(gè)保守氨基酸殘基結(jié)合，這些氨基酸通常為組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或賴氨酸。還有一部分中性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，這部分蛋白酶主要是以絲氨酸?；孽；?酶作為催化機(jī)制。表3主要?dú)w納了近3年國內(nèi)、 外關(guān)于金屬離子及其添加量對(duì)不同來源中性蛋白酶活性影響的研究。

表3 金屬離子作用微生物中性蛋白酶的研究Table3 Study on the effect of metal ions on microbial neutral protease

2.2.1 金屬離子激活中性蛋白酶機(jī)理研究 在中性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究中，Ca2+往往表現(xiàn)為明顯激活作用，其影響機(jī)理主要是中性蛋白酶往往不耐高溫，Ca2+能夠維持中性蛋白酶的空間構(gòu)象，提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性，從而提高蛋白酶活性，因此Ca2+常常作為穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。Zn2+對(duì)于部分中性蛋白酶起激活作用，激活機(jī)理往往是這部分中性蛋白酶活性部位不含Zn2+，Zn2+能通過疏水鍵結(jié)合、 金屬結(jié)合和離子相互作用等方式提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性，從而提高中性蛋白酶活性[26]。如枯草桿菌中性蛋白酶就是一種金屬含鋅酶，其活性中心含一個(gè)Zn2+[27]，Zn2+作為酶的催化活性中心，它對(duì)維持酶的活性及其活性部位構(gòu)象具有重要作用，而在大部分研究中添加Zn2+往往表現(xiàn)為抑制作用。Mg2+對(duì)于大部分菌株所產(chǎn)的中性蛋白酶起激活作用，激活機(jī)理主要是Mg2+置換了中性金屬蛋白酶活性部位的部分Zn2+，改變了蛋白酶活性位點(diǎn)微環(huán)境，這種改變有利于中性蛋白酶活性的提高[28]。另一種原因則是Mg2+與中性蛋白酶結(jié)構(gòu)中除活性位點(diǎn)外的其它氨基酸附著點(diǎn)相結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵，從而提高相應(yīng)的酶活[29]。K+和Li+對(duì)中性蛋白酶的作用機(jī)理與此機(jī)理相似，都是與保守氨基酸殘基結(jié)合并參與催化反應(yīng)，提高中性蛋白酶催化效率。

2.2.2 金屬離子抑制中性蛋白酶機(jī)理研究 表3中Zn2+對(duì)中性蛋白酶活性主要起抑制作用，其抑制機(jī)理為大部分中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶，其活性中心含有Zn2+，添加過量Zn2+往往會(huì)抑制中性蛋白酶活性，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[30]；研究發(fā)現(xiàn)部分金屬離子能替代中性蛋白酶活性部位的金屬離子，這種替代反應(yīng)造成了活性部位結(jié)構(gòu)的不利改變，從而抑制其活性[31]；高濃度的Fe3+、Ge2+和Co2+等重金屬離子能與反應(yīng)體系螯合或與蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，破壞蛋白酶空間結(jié)構(gòu)，致使蛋白酶活性顯著抑制，甚至失活。胡皆漢[32]在研究枯草桿菌中性蛋白酶與Co（Ⅱ）相互作用的核磁共振譜中發(fā)現(xiàn)，枯草桿菌中性蛋白酶活性中心的Zn（Ⅱ）與外加的Co（Ⅱ）存在直接相互作用，Co（Ⅱ）部分置換原酶活性中心的Zn（Ⅱ），形成“Co-NP”酶衍生物，影響酶的催化活性。

2.3 金屬離子對(duì)微生物堿性蛋白酶影響研究

微生物堿性蛋白酶來源較廣，其最適反應(yīng)pH值主要在8.0～12.0。微生物堿性蛋白酶活性位點(diǎn)有半胱氨酸、巰基和絲氨酸，其中以絲氨酸為主，故堿性蛋白酶又稱為絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶由絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）組成的催化三元體所表征。它們按照Ser-His，His-Asp 成對(duì)起作用。以第2 個(gè)組氨酸代替天冬氨酸揭示了天冬氨酸的輔助性質(zhì)，所有催化步驟都是由Ser-His 二元體完成。部分金屬離子能夠與堿性蛋白酶的活性位點(diǎn)殘基發(fā)生反應(yīng)，改變堿性蛋白酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致堿性蛋白酶活性發(fā)生改變。表4中針對(duì)近6年國內(nèi)、外關(guān)于金屬離子作用微生物堿性蛋白酶活性的相關(guān)研究進(jìn)行了歸納。

表4 金屬離子作用微生物堿性蛋白酶的研究Table4 Study on the effect of metal ions on microbial alkali protease

2.3.1 金屬離子激活堿性蛋白酶機(jī)理研究 枯草桿菌堿性蛋白酶屬于絲氨酸型蛋白酶家族，其活性位點(diǎn)具有一個(gè)絲氨酸關(guān)鍵殘基，此殘基是天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸催化三元體的一部分，枯草

3 總結(jié)與展望

金屬離子提高蛋白酶活性的機(jī)理可分為三大類。第一類主要是提高蛋白酶穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。金屬離子特別是二價(jià)金屬離子與蛋白酶分子中的基團(tuán)發(fā)生聯(lián)結(jié)形成金屬鍵，對(duì)維持蛋白酶空間構(gòu)型方面起到一定穩(wěn)定作用。金屬離子還能有效促進(jìn)蛋白酶分子鏈內(nèi)和鏈間的氫鍵作用及肽鏈的穩(wěn)定折疊或部分折疊狀態(tài)。第二類主要是金屬陽離子通過與除活性位點(diǎn)外的其它氨基酸附著點(diǎn)相結(jié)合來提高蛋白酶活力。金屬離子通過與內(nèi)源和外源配體配位，形成金屬活性部位，這部分金屬離子常常作為激活劑使用，其中最常見的金屬離子是Zn2+，其次是Co2+、Mn2+和Cu2+。第三類是金屬離子在催化反應(yīng)過程中傳遞電子，進(jìn)行親電或者親核攻擊，促進(jìn)酶和底物的結(jié)合等作用。

筆者曾從霉豆瓣中分離得到一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，在研究其酶學(xué)特征過程中發(fā)現(xiàn)添加微量的Mn2+和Cu2+對(duì)其酶活有顯著提高，且與對(duì)照組相比表現(xiàn)出明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，從而大大縮短了發(fā)酵周期。在低溫條件下，筆者發(fā)現(xiàn)添加Mn2+和Cu2+的試驗(yàn)菌株其生長速率和蛋白酶活性都比對(duì)照組表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。目前很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)仍處于落后階段，其發(fā)酵過程處于開放式環(huán)境，季節(jié)變化對(duì)實(shí)際生產(chǎn)影響較大。一年中霉豆瓣的生產(chǎn)主要在6月～8月，環(huán)境溫度低于28 ℃將會(huì)延長發(fā)酵周期，增加生產(chǎn)成本。針對(duì)金屬離子能在低溫條件下提高酶活和生長速率這一特性，若將其運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于企業(yè)提高生產(chǎn)效率和節(jié)約生產(chǎn)成本具有重要意義。筆者在Cu2+激活米曲霉蛋白酶活性機(jī)理的研究過程中發(fā)現(xiàn)，Cu2+激活蛋白酶活性主要與蛋白酶等電點(diǎn)、 氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。在研究Cu2+激活蛋白酶機(jī)理過程中，筆者發(fā)現(xiàn)純化所得的蛋白酶量較少，酶活損耗較大，從而增加了試驗(yàn)難度，優(yōu)化層析方法有助于解決這一難題。目前國內(nèi)、外對(duì)于金屬離子影響蛋白酶活性的機(jī)理研究尚處于初級(jí)階段，仍需要進(jìn)一步探索。深入研究金屬離子激活蛋白酶活性的機(jī)理為今后研究蛋白酶催化機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，更為今后闡明蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)。桿菌蛋白酶家族至少有一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，這使得它們具有良好的熱穩(wěn)定性[39]。在多位學(xué)者[40-41]的研究中，Ca2+、Mn2+和Mg2+對(duì)來自芽孢桿菌屬產(chǎn)生的堿性蛋白酶活性都有明顯提高，其中Ghorbel[42]從蠟狀芽孢桿菌BG1 中分離純化得到堿性蛋白酶，分別添加5 mmol/L Ca2+、Mg2+和Mn2+作用后蛋白酶相對(duì)酶活達(dá)到450%、285.5%和157.5%。Ca2+、Mn2+和Mg2+提高堿性蛋白酶酶活的國內(nèi)、 外相關(guān)報(bào)道[42-43]有很多，而關(guān)于其影響機(jī)理的研究甚少。Ca2+對(duì)大多數(shù)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有明顯的增強(qiáng)作用[44]，研究認(rèn)為Ca2+提高堿性蛋白酶活性的機(jī)理主要是在一定溫度條件下Ca2+能夠保護(hù)堿性蛋白酶不發(fā)生熱變性，且在高溫情況下也能避免其構(gòu)象發(fā)生改變[45]。在絲氨酸蛋白酶空間結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)其活性部位含有兩個(gè)鈣的結(jié)合位點(diǎn)，去除強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)上的一個(gè)鈣離子將使蛋白酶熱穩(wěn)定性顯著下降[46]，進(jìn)一步驗(yàn)證了Ca2+對(duì)于堿性蛋白酶熱穩(wěn)定性方面具有重要作用。對(duì)于Mn2+和Mg2+影響堿性蛋白酶活性的機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，Mn2+和Mg2+能與堿性蛋白酶分子中的側(cè)鏈氨基酸殘基結(jié)合，并在不改變堿性蛋白酶催化構(gòu)象的基礎(chǔ)上穩(wěn)定堿性蛋白酶的分子構(gòu)象，調(diào)節(jié)堿性蛋白酶活性。然而，大量研究中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)于不同來源的堿性蛋白酶作用效果往往表現(xiàn)出較大差異，其原因可能與不同堿性蛋白酶氨基酸序列及其高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。對(duì)于Na+和K+提高堿性絲氨酸蛋白酶活性機(jī)理，除在Wang[47]的文獻(xiàn)中提及與蛋白酶穩(wěn)定性有關(guān)外，暫無其它報(bào)道。因此Na+和K+提高蛋白酶活性的機(jī)理可能是增強(qiáng)了堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Becker[48]的研究也證實(shí)了堿性蛋白酶在室溫條件下堿金屬鹵化物、 堿金屬磷酸鹽和堿金屬碳酸鹽等的加入能夠增強(qiáng)堿性蛋白酶的穩(wěn)定性，其中以氯化鈉效果最為顯著。

2.3.2 金屬離子抑制堿性蛋白酶機(jī)理研究 重金屬抑制堿性蛋白酶活性的文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要是金屬汞、鎘、鉛等與堿性蛋白酶分子中的巰基反應(yīng)將其轉(zhuǎn)換為硫醇，或者是與堿性蛋白酶中的組氨酸和色氨酸殘發(fā)生反應(yīng)，從而抑制酶的活性。此外，通過銀和汞的作用可將堿性蛋白酶分子中的二硫鍵通過水解的方式降解[49]。這些不可逆反應(yīng)的發(fā)生使得堿性蛋白酶活性降低或徹底失活。