胞壁酸研究進(jìn)展

胡婕倫 劉麗萍 傅博強(qiáng) 聶少平 謝明勇*

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室 南昌330047 2 中國計量科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)與生物計量研究所 北京100029）

胞壁酸（Muramic acid），分子式為C9H17NO7。胞壁酸是細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖 （Peptidoglycan）結(jié)構(gòu)的重要組成部分[1]，是原核微生物細(xì)胞的生物標(biāo)志化合物[2]。1954年，Strange 和Powell 在數(shù)種芽孢桿菌的芽孢皮層中，Cummins 和Harris 在許多G+菌細(xì)胞壁中，通過Morgan-Elson 反應(yīng)最先發(fā)現(xiàn)這一種酸性氨基六碳糖[3]；1956年，Strange 和Dark以離子交換法從芽胞肽的酸水解物中制出胞壁酸的純結(jié)晶[3]；1959年，Strange 和Kent 確定該結(jié)晶的構(gòu)造為2-氨基-3-O-（1-羧乙基）-2-脫氧-D-葡萄糖[3]。胞壁酸在相關(guān)酶的作用下發(fā)生乙酰基化反應(yīng)，生成N-乙酰胞壁酸 （N-acetyl muramic acid），N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺 （Nacetyl-glucosamine，NAG）相互間隔，經(jīng)β-1，4 糖苷鍵連接成長鏈，構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的基本骨架。

作為原核微生物細(xì)胞的生物標(biāo)志化合物，胞壁酸的應(yīng)用范圍十分廣泛，常用于評價細(xì)菌或藍(lán)藻的生物量，以此來推測不同環(huán)境中的微生物總量[4-15]。例如，檢測從灰塵、土壤、沉積物、食品包裝材料、 甚至動物組織等不同環(huán)境中采集的樣品中的胞壁酸含量，可以推測出其中細(xì)菌的含量。胞壁酰二肽（MDP）中具有胞壁酸結(jié)構(gòu)，MDP 是分枝桿菌細(xì)胞骨架中具有免疫佐劑活性的最小結(jié)構(gòu)單位，具有重要的免疫學(xué)意義。MDP 可以激活巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，除此之外，對免疫物質(zhì)如抗體、補(bǔ)體和細(xì)胞因子的生成和激活也有作用，對細(xì)胞免疫或體液免疫都具有廣泛而重要的影響[16]。很多文獻(xiàn)表明，胞壁酸是一種睡眠促進(jìn)因子的組合物，此睡眠因子有利于提高人體免疫力。胞壁酸在植物凝集素、潛在細(xì)菌酶抑制劑，以及抗腫瘤作用等方面有很大的研究前景。近年來，許多科研工作者研究了胞壁酸的檢測方法，目前文獻(xiàn)報道的方法有自動氨基酸分析法、分光光度法、薄層層析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、高效毛細(xì)管電泳法等。本文就胞壁酸的理化性質(zhì)、生理功能和應(yīng)用、檢測方法進(jìn)行概述。

1 胞壁酸理化性質(zhì)

胞壁酸，化學(xué)名2-氨基-3-O-（1-羧乙基）-2-脫氧-D-葡萄糖，相對分子質(zhì)量為251.23。分析其結(jié)構(gòu)可知，胞壁酸是D-葡萄糖胺的C3 位與D-乳酸的C2 位的羥基以醚鍵連接而形成的產(chǎn)物。胞壁酸熔點(diǎn)較高，153 ℃，常溫下外觀呈固體粉末狀，無氣味。胞壁酸易溶于水，其水溶液呈弱酸性，pH值接近中性。胞壁酸的分子結(jié)構(gòu)中含有較多羥基，極性大，比葡萄糖胺的極性小[17]。除易溶于水外，胞壁酸還可溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶劑[17]。胞壁酸的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 胞壁酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of muramic acid

胞壁酸的化學(xué)性質(zhì)比較活躍，易與酸堿反應(yīng)，以離子形式存在溶液中。胞壁酸容易被強(qiáng)氧化性物質(zhì)（如銀離子、溴水）、強(qiáng)酸（如硫酸、硝酸）等氧化。此外，胞壁酸還可以被硝酸銀、茚三酮、對甲氧基苯胺、聯(lián)苯胺、苯胺-二苯胺、苯胺-鄰苯二甲酸試劑等氧化染色，也可以和Ehrlich 試劑發(fā)生顏色反應(yīng)[17]。胞壁酸是一種氨基糖，具有氨基糖的通性，在加熱條件下，容易和氨基酸產(chǎn)生Maillard 反應(yīng)和焦糖化作用[17]。

2 胞壁酸生理功能和應(yīng)用

胞壁酸是細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的組成成分，在檢測各種環(huán)境中（例如土壤、食品、灰塵、組織等）的細(xì)菌含量時，胞壁酸常常作為一項重要檢測指標(biāo)。此外，胞壁酸也可作為臨床醫(yī)學(xué)檢測中的一種抗體，有試驗指出，胞壁酸不被溶菌酶所溶解，可激活補(bǔ)體，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，并能與γ 球蛋白起反應(yīng)，可與人體黏膜細(xì)胞連結(jié)，減少細(xì)菌的吸附，其在致病中的作用還需要進(jìn)一步研究闡明[18]。在目前現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道中，胞壁酸主要有以下生理功能和應(yīng)用。

2.1 胞壁酸是微生物總量的重要評價指標(biāo)

目前，胞壁酸最常用作微生物總量的標(biāo)記物，以此來評價不同環(huán)境如土壤、灰塵、河水泥沙沉積物、食品包裝材料，甚至動物組織等的微生物量。胞壁酸的含量不僅可以評價環(huán)境微生物含量的多少，還可以表示微生物的污染程度、表征土壤的肥力、代表組織的病變程度等。王晶等[19]在對土壤有機(jī)質(zhì)的研究中介紹了一種新的量化指標(biāo)，他們指出，微生物對土壤有機(jī)物有轉(zhuǎn)化和積累的作用，這種作用的大小可以通過土壤中氨基糖的含量多少來評價，而土壤中的氨基糖主要有氨基葡萄糖（Glu）、氨基半乳糖（Gla）、氨基甘露糖（Man）和胞壁酸（Mur）等。其中，胞壁酸和氨基甘露糖的多少不僅可以反映細(xì)菌誘導(dǎo)氮在土壤中的下跌程度，還可以解釋細(xì)菌對土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化和積累作用的大小[19]。從對土壤氨基糖濃度的研究中，可以發(fā)現(xiàn)微生物對土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）轉(zhuǎn)化的線索，因為氨基糖的含量反映了土壤中微生物起源的有機(jī)態(tài)氮的特征[19]。張旭東等[20]研究表明，胞壁酸在當(dāng)今已經(jīng)引起較大的關(guān)注，他們經(jīng)過大量的研究，得到了細(xì)菌是胞壁酸的唯一來源這一結(jié)論。Poole 等[21]為了測量不同農(nóng)業(yè)環(huán)境中的胞壁酸、 麥角甾醇等化學(xué)成分，從豬舍、谷倉、儲存室采集灰塵樣本，推測出不同環(huán)境灰塵中的微生物群落誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥發(fā)生的能力不同。Mielniczuk 等[11]采集了食品包裝材料和實驗室環(huán)境中的灰塵樣本，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測其中胞壁酸含量，從而推測出食品包裝材料和實驗室環(huán)境中的灰塵中的細(xì)菌含量，為胞壁酸的檢測提供了一種快速可靠的方法?？傊谒岷康亩嗌倏梢栽u價環(huán)境中的微生物含量，表示微生物污染程度，表征土壤的肥力，代表組織的病變程度等。

2.2 胞壁酸可與豆科植物凝集素相互作用

Ayouba 等[22]研究比較了胞壁酸和N-乙酰胞壁酸在各種豆科植物外源凝集素中的抑制效力，采用血凝抑制技術(shù)研究半乳糖胺具體凝集素。研究結(jié)果表明，單糖和它們的衍生物可以跟植物凝集素產(chǎn)生特異性相互作用，與其它單糖和它們的衍生物相比，胞壁酸和乙酰胞壁酸跟植物凝集素產(chǎn)生的這種特異性相互作用更大。Ayouba 在此項研究中還發(fā)現(xiàn)了特異性凝集素與乙酰胞壁酸的交互作用導(dǎo)致不同的植物凝集素容易凝集一些細(xì)菌菌株，因為細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中乙酰胞壁酸的含量很高。Bourne 等[23]從山黧豆的種子里提取出一種凝集素，與細(xì)菌細(xì)胞壁中的胞壁酸和胞壁酰二肽相互作用形成復(fù)合物，研究這兩種復(fù)合物精制的高分辨率的X 射線結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)凝集素對胞壁酸有較高的親和力，說明植物對外源凝集素的選擇是立體的。

2.3 胞壁酸在臨床醫(yī)學(xué)方面可作為一種檢測抗體

廣為使用的抗葡萄球菌溶血素測定（ASta）不甚敏感，在葡萄球菌心內(nèi)膜炎的診斷上，胞壁酸抗體 （TAAs） 提供了一種十分有用的檢查方法。Larinkari[24]研究了TAAs 在葡萄球菌菌血癥中的面貌和TAAs 與ASta 試驗之間的關(guān)系，證明了與抗葡萄球菌溶血素試驗相比較，胞壁酸抗體試驗在葡萄球菌菌血癥的診斷檢測上特異性大致相同，卻更為敏感。在指導(dǎo)治療金黃色葡萄球菌感染的患者時，可以檢測其胞壁酸抗體，如果胞壁酸抗體呈陰性，則說明無并發(fā)癥；如果胞壁酸抗體呈陽性，則需要延長治療時間[18]。

2.4 胞壁酸是免疫佐劑的組成成分之一

很多學(xué)者研究改進(jìn)胞壁酸和短肽鏈的人工合成方法，生成具有免疫佐劑、免疫調(diào)節(jié)劑等作用的生物活性物質(zhì)，如胞壁酰二肽（MDP）、胞壁酰三肽等?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)研究表明，MDP 及其類似物是一種強(qiáng)有力的免疫佐劑，對免疫系統(tǒng)有重要的生理作用。它可以激活多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1（lL-l）的產(chǎn)生，提高細(xì)胞免疫和體液免疫的功能，促進(jìn)補(bǔ)體、擾體的生成和激活，除此之外，它在抗細(xì)菌、真菌、抑制腫瘤等方面也有明顯作用[25]。MDP 是由N-乙酰胞壁酸和二肽鏈通過酰基連接形成的產(chǎn)物，MDP 類似物（如胞壁酰三肽、胞壁酰四肽等）的分子結(jié)構(gòu)中也含有胞壁酸。

2.5 胞壁酸是一種睡眠促進(jìn)因子的組合物

睡眠的好壞對人體免疫力的強(qiáng)弱有明顯的影響，二者密切相關(guān)，優(yōu)質(zhì)睡眠有助于提高人體內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量。有專家研究指出，人體在睡眠時，大腦里會產(chǎn)生一種睡眠因子——胞壁酸，此睡眠因子不僅可以提高血液中的白細(xì)胞數(shù)量，激活巨噬細(xì)胞，而且可以增強(qiáng)肝臟的解毒功能，從而有效清除侵入人體的細(xì)菌和病毒，提高人體抗病能力[26]。Krueger 等[27]從人排出的尿中分離出睡眠促進(jìn)因子化合物——小的糖肽，通過氨基酸-氨基糖分析表明該糖肽組成為谷氨酸、丙氨酸、二氨基庚二酸和胞壁酸，它們的物質(zhì)的量比為2 ∶2 ∶1 ∶1。Krueger 等選擇多名健康成年男性，采集了4.5 t尿液，對其進(jìn)行分離和純化，從中得到30 μg 這種小的糖肽。在實驗兔子大腦內(nèi)的側(cè)腦室注射了這種睡眠促進(jìn)因子，注射量為大約5 pmol/kg 體重，發(fā)現(xiàn)兔子的慢波睡眠增加了50%，根據(jù)電生理和行為標(biāo)準(zhǔn)判斷，這種增加的睡眠是正常的，它類似于動物在長時間缺少睡眠后，被允許睡覺時進(jìn)入的深度睡眠狀態(tài)。

2.6 胞壁酸是復(fù)合糖化物的組成成分

很多復(fù)合糖化物中含有胞壁酸，它們具有生物活性，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用。糖復(fù)合物主要由糖鏈和非糖部分組成。糖鏈可以通過乙酰胞壁酸和其它氨基糖聚合而成，在此基礎(chǔ)上再與肽鏈結(jié)合，從而形成各種肽聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白等生物大分子，或者再與脂類連接，形成脂多糖和糖脂。糖復(fù)合物具有重要的生理功能，它不僅可以對物質(zhì)成分進(jìn)行識別，還可以影響蛋白質(zhì)分子的生物活性[17]。Ottaviani 等[28]從軟體動物的腹足中提取出了某種糖蛋白，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有胞壁酸結(jié)構(gòu)，這種胞壁酰糖蛋白可以替代唾液酸。

3 胞壁酸檢測方法

在胞壁酸的檢測分析方面，現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)中介紹了很多方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。胞壁酸可以在自動氨基酸分析儀中直接進(jìn)樣分析。除此之外，最常見的檢測方法是先用衍生試劑處理胞壁酸，將胞壁酸轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的易揮發(fā)、穩(wěn)定、有色的衍生化合物，再采用比色法、中紅外光譜法、氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、薄層色譜法等方法測定。樣品處理的步驟不同，試驗條件的不同，所選擇的檢測方法也不同。在具體的試驗方案中，要根據(jù)樣品特點(diǎn)、檢測目的選擇合適的檢測方法。

3.1 氨基酸分析法

Moore 等[29]在1958年首先實現(xiàn)了氨基酸分析的自動化。他們將蛋白質(zhì)水解生成的氨基酸通過陽離子交換色譜進(jìn)行分離，再將分離出的各種氨基酸與柱后茚三酮試劑衍生結(jié)合，成功分析了多種氨基酸。胞壁酸分子結(jié)構(gòu)中也存在氨基和羧基，與氨基酸分子有相似之處，因此也可用自動氨基酸分析儀來檢測胞壁酸。張祝蘭等[30]在對紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架中的肽聚糖進(jìn)行分析時，采用鹽酸酸解樣品，再將酸解后的樣品通過氨基酸自動分析儀分析，從中發(fā)現(xiàn)了胞壁酸。

3.2 氣相色譜法

氣相色譜法選擇性高，靈敏度高，分析速度快，應(yīng)用范圍廣，然而要求樣品氣化，不適用于大部分沸點(diǎn)高和熱不穩(wěn)定的化合物[31]。胞壁酸沸點(diǎn)高，不能直接通過氣相色譜儀檢測，所以要根據(jù)實際情況選擇合適的衍生試劑處理胞壁酸，將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、對熱較穩(wěn)定的衍生物，再進(jìn)樣分析。在儀器分析領(lǐng)域，經(jīng)常將氣相色譜和質(zhì)譜儀聯(lián)用，對復(fù)雜的混合物進(jìn)行分離分析，充分發(fā)揮這兩種儀器的優(yōu)勢。Christensson[9]首次報道了使用氣-質(zhì)聯(lián)用法檢測感染的滑膜液（SF）中的胞壁酸，證明了胞壁酸可以作為一種化學(xué)標(biāo)記證明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中活細(xì)菌或細(xì)菌碎片的存在。Christensson 在12例敗血癥樣品中確定了胞壁酸的可檢測水平，同時發(fā)現(xiàn)，這些樣品中的低細(xì)菌菌落計數(shù)的樣品和20 名對照組患者的SF 樣品中均未檢測到胞壁酸。因此，敗血癥滑膜液中可檢測的胞壁酸含量水平可以作為對反應(yīng)性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究的陽性對照。Zhang 等[20]用鹽酸水解土壤樣品，得到4種水解產(chǎn)物并進(jìn)行衍生反應(yīng)，利用高分辨率的氣相色譜裝置同時確定這4 種衍生物，該方法敏感度較高，小于10 μg/mL 胞壁酸的和小于20 μg/mL的其它3 種氨基糖均被檢出。蘇華等[32]通過色-質(zhì)聯(lián)用法證明胞壁酸存在沙眼衣原體中。

3.3 高效液相色譜法

在對糖類物質(zhì)的分析研究中，高效液相色譜（HPLC）法也是常用的一種方法。HPLC 分辨率高，分析速度快，分離效能高，靈敏度高，而且樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，容易回收，有較大的應(yīng)用范圍[33]。采用HPLC 分析胞壁酸，樣品經(jīng)色譜柱分離后，進(jìn)行柱后衍生，然后采用紫外-可見檢測器檢測，胞壁酸在199 nm 處有最大吸收波長[34]。Indorf等[13]對反相高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，通過鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生和熒光檢測法測定土壤和植物水解產(chǎn)物中的胞壁酸、甘露糖胺、葡糖胺和半乳糖胺。改進(jìn)后的方法保留時間減少，并通過改變流動相優(yōu)化了胞壁酸和甘露糖胺的分離。Indorf等[13]還測定了激發(fā)波長、OPA 反應(yīng)時間、四氫呋喃濃度和流動相的pH 值對氨基糖分離的影響。Zelles[35]研究了土壤樣品中的胞壁酸和葡萄糖胺的最佳釋放和定量估計?？疾焖鈼l件、HCl 濃度、水解時間、 土壤干重與酸的比例和參考物質(zhì)回收率的影響。在土壤水解產(chǎn)物殘留物中加入2-巰基乙醇，通過優(yōu)化鄰苯二甲醛與反應(yīng)混合物中的水解產(chǎn)物的相對量、 兩者的pH 以及溫育條件來實現(xiàn)熒光試劑鄰苯二甲醛的衍生化期，發(fā)現(xiàn)熒光響應(yīng)與被測物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。使用高效液相色譜得到胞壁酸以及葡萄糖胺的鄰苯二甲醛衍生物的單峰，并在短時間內(nèi)實現(xiàn)了在皮摩爾水平下與干擾物質(zhì)的完全分離。

3.4 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）設(shè)備簡單，操作方便，容易顯色，展開速率快，混合物易分離，但是對生物高分子的分離效果不太理想。高效薄層色譜法在多個領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。從胞壁酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，含有較多羥基，極性大，在使用硅膠板進(jìn)行分離時易形成氫鍵，不利于樣品的展開，所以在分離胞壁酸時應(yīng)該選擇極性大的溶劑作為展開劑。Steven 等[36]采用異丙醇∶乙酸∶水（9∶1∶1）作為展開劑，分離河口沉積物沙渣里的胞壁酸，試驗在27 cm（長）×8 cm（寬）×22 cm（高）的展開缸內(nèi)進(jìn)行，采用0.25 mm 厚的沒有石膏粘合劑的未活化的Polygram Sil G（20×20 cm）薄層板，展開分離樣品后，進(jìn)行刮板溶解，再通過氣-質(zhì)聯(lián)用法測定出海泥中的胞壁酸含量為11.3×10-12mol/g。

3.5 比色分析法

比色分析法簡單易行，然而干擾因素多，測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。它的分析原理是樣品中某種元素不同價態(tài)的離子或基團(tuán)有該種離子或基團(tuán)特定的顏色，這種顏色深淺與離子或基團(tuán)的濃度有嚴(yán)格的線性關(guān)系，只要沒有其它干擾因素，這種比例關(guān)系可以對樣品溶液中的離子濃度進(jìn)行分析。Taylor[37]修改了Barker 和Summerson 的測定乳酸的比色法，建立了一種簡單而快速的測量乳酸、胞壁酸和甘油醛的比色分析法，該分析法可以在開放的試管中進(jìn)行，而且不需要比分光光度計更復(fù)雜的設(shè)備。樣品在加熱的濃硫酸中釋放乙醛，乙醛與硫酸銅和對苯基苯酚（pPP）反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在570 nm處有吸收波長，可用分光光度計進(jìn)行比色分析。

4 總結(jié)

胞壁酸有許多重要的生理功能，隨著對胞壁酸的深入研究，胞壁酸的檢測方法也得到了快速發(fā)展并不斷改進(jìn)，在食品衛(wèi)生、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境污染監(jiān)測等得到廣泛應(yīng)用。另外，近年來對糖的衍生物和復(fù)合物的研究十分活躍，隨著對多糖和糖復(fù)合物的深入研究分析，人們對糖的功能有新的認(rèn)識，取得了不少新進(jìn)展，例如開發(fā)新型氨基糖苷類抗生素藥物、免疫促進(jìn)劑等。胞壁酸作為一種氨基糖，有廣闊的開發(fā)前景。