外源性硼酸在大豆制品
——腐竹中的形態(tài)研究

馬曉清 汪東風(fēng) 徐 瑩 袁永凱 孫 遜 劉成珍 錢怡霖

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266003）

硼元素是參與人體正常代謝過(guò)程中的重要非金屬元素[1]，也是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)元素[2-3]。植物源食品中均含有硼，其中大豆及大豆制品是我國(guó)常見(jiàn)食品中內(nèi)源性硼含量（平均值）最多的食物，對(duì)我國(guó)居民的硼攝入量影響較大[4]。由于地區(qū)及飲食習(xí)慣的不同，人體日均硼攝入量區(qū)間為2～20 mg/kg[5]。硼酸常被不法商販用來(lái)改善腐竹品質(zhì)，研究表明過(guò)量攝入硼酸對(duì)人體有害[6]。我國(guó)1979年將硼酸和硼砂列為非法食品防腐添加劑，2008年又將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單》 進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)督[7]。然而目前的檢測(cè)手段難以區(qū)分腐竹中的硼是原料帶入（內(nèi)源性硼） 還是非法添加 （外源性硼酸）。李金林等[8]對(duì)大豆、腐竹中硼本底值進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)大豆、腐竹中硼本底值存在較大差異，若以此為標(biāo)準(zhǔn)判斷腐竹中是否非法添加外源性硼，其結(jié)果會(huì)存在較大誤差。

硼酸可與醇類化合物（尤其對(duì)鄰二醇有較高的親和性[9-10]）脫水形成硼酸酯類化合物（圖1）。食品中存在大量多醇類化合物如糖類、蛋白等，這為硼酸在食品中生成單酯或二酯提供了有利條件。食品中可能存在不溶形態(tài)、游離形態(tài)、單酯形態(tài)以及二酯形態(tài)等硼化合物。黃麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)大豆制品由于加工工藝不同，其硼形態(tài)存在較大差異，而外源性硼主要以硼酸和硼砂的形式進(jìn)入食品，嚴(yán)重影響食品質(zhì)量[12]。關(guān)于硼酸有害性研究，目前主要通過(guò)硼酸為硼源做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[13]。然而，不同形態(tài)的硼化合物有不同的生理活性[14-15]，過(guò)量的硼酸對(duì)人體有較高的毒性；而另一種硼酸二酯形態(tài)的天然硼化合物——果糖硼酸鈣[16]，卻有較好的生物活性，以保健品的形式銷售。有研究顯示脫羧硼酸糖酯[17]可能將是一類新型功能成分。由此可知，不同形態(tài)以及不同含量的硼化合物其營(yíng)養(yǎng)性和安全性均有較大差異。目前關(guān)于大豆等植物源食品中硼的安全性評(píng)估仍不全面，外源性硼在腐竹中的存在形態(tài)也未見(jiàn)報(bào)道。

本研究為了確定外源性硼在腐竹中的形態(tài)，在腐竹制備過(guò)程中添加不同量的外源性硼酸，利用以Sephadex G50 為填料的凝膠柱分離腐竹中不同形態(tài)的硼復(fù)合物，以期為檢測(cè)腐竹中是否違禁添加外源性硼酸提供科學(xué)依據(jù)。最后利用11B NMR 進(jìn)一步鑒定外源性硼酸在腐竹中的形態(tài)，為開(kāi)發(fā)具有良好生物活性的食源性硼化合物提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圖1 硼酸的酯化反應(yīng)Fig.1 Esterification of boric acid

1.1.1 材料與試劑 大豆，青島市利群超市；Sephadex G50（Superfine），由GE Healthcare 公司生產(chǎn)；偶氮甲堿H（CAS：5941-07-1），梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；DMSO-d6（D，99.9%），由美國(guó)CIL （Cambridge Isotope Laboratories，Inc）公司生產(chǎn)；硼標(biāo)準(zhǔn)液，國(guó)家有色金屬及電子材料測(cè)試中心；Tris、EDTA·Na2，索萊寶生物科技有限公司；硼酸、乙酸銨、無(wú)水乙醚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；層析柱（2.6 cm×100 cm），上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠；石英核磁管，美國(guó)NORELL 公司。

1.1.2 儀器設(shè)備 BSZ-100 自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；豆?jié){機(jī)，中山市美斯特實(shí)業(yè)有限公司；核磁共振分析儀，美國(guó)安捷倫公司；高速萬(wàn)能破碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；GL-20B 型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-3 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；蘭格精密蠕動(dòng)泵BT100-2J，保定蘭格恒流泵有限公司；馬弗爐，龍口市電爐制造廠。為避免硼污染，試驗(yàn)過(guò)程所用水均為超純水，試劑均為分析純級(jí)，容器均為塑料材質(zhì)或石英材質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備及前處理 腐竹制備的工藝流程：選豆→泡豆→磨漿→分離→煮漿（添加不同量的硼酸）→揭膜→提取腐竹→烘干[18-19]。

在煮漿過(guò)程中分別加入0%，5%，10%，15%，20%，30%（以大豆干重計(jì)）的外源性硼酸，并將制備的腐竹分別命名為：0%腐竹，5%腐竹，10%腐竹，15%腐竹，20%腐竹，30%腐竹。

水溶性硼酸及其酯類化合物的提?。悍謩e稱取一定質(zhì)量的不同腐竹進(jìn)行粉碎，采用索氏抽提法以無(wú)水乙醚為溶劑進(jìn)行脫油脂處理[20]，稱取脫除油脂后的腐竹粉末1.5 g，加入75 mL 超純水（料液比1∶50），超聲處理2 h，離心取上清液冷凍干燥，凍干樣品置于干燥器中備用。

1.2.2 甲亞胺-H 法測(cè)定硼含量[21]

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別吸取硼標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 mg/L）0，0.1，0.3，0.5，0.7，1 mL 于10 mL 聚丙烯管中加水至5 mL，加入2 mL 乙酸銨緩沖液（pH 5.6），再加入2 mL 甲亞胺-H 顯色溶液，搖勻放置90 min 后在420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以硼濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.2.2 樣品測(cè)定 參照Lohse[21]的方法并稍作修改，測(cè)定凍干樣品中總硼含量。稱取10 mg 樣品于瓷坩堝中，加1%Na2CO3溶液5 mL，電爐上慢熱蒸干炭化至無(wú)煙，然后放入馬弗爐500 ℃左右灰化完全，用2 mL 5%HCl 溶解坩堝中內(nèi)容物，加水定容至50 mL，搖勻備用作測(cè)試溶液。取測(cè)試樣液5 mL 按照1.2.2.1 中方法測(cè)定吸光值，計(jì)算含量。

1.2.3 Sephadex G50 分離硼酸及其復(fù)合物

1.2.3.1 Sephadex G50 預(yù)處理與裝填[22]在室溫下，將葡聚糖凝膠干粉浸泡于超純水中24 h，并不斷輕微攪拌以保證凝膠溶脹。將溶脹好的凝膠一次性裝入柱內(nèi)（2.6 cm×100 cm），保持濕態(tài)裝柱，并避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或斷層，裝柱要均勻。用平衡液（pH 8，10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液）平衡層析柱至少3～5 個(gè)柱體積，直至流出液的pH 值為8。

1.2.3.2 Sephadex G50 分離硼酸標(biāo)準(zhǔn)液 參照Pfeffer 等[23]的方法并稍做修改，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液進(jìn)行分離并測(cè)定含量，以確定標(biāo)準(zhǔn)硼酸的洗脫體積。洗脫液為pH 8，10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，用恒流泵控制流速為0.714 mL/min。分別配制200，300，400，500 μmol/L 的硼酸標(biāo)準(zhǔn)液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，上樣10 mL，流出液用自動(dòng)部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亞胺-H 法測(cè)定硼含量。

1.2.3.3 Sephadex G50 分離果糖硼酸復(fù)合物 配制一定濃度的硼酸果糖混合溶液（硼酸5 mmol/L，果糖500 mmol/L），攪拌30 min，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，上樣10 mL，流出液用自動(dòng)部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亞胺-H 法測(cè)定硼含量。

1.2.3.4 Sephadex G50 分離腐竹中硼及其復(fù)合物按照1.2.3.2 中的方法條件，對(duì)樣品中硼酸及其復(fù)合物進(jìn)行分離并測(cè)定含量。準(zhǔn)確稱取0.0100 g凍干樣品，溶于100 mL 超純水中，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，流出液用自動(dòng)部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亞胺-H 法測(cè)定硼含量。

1.2.411B NMR 掃描[24]分別稱取凍干樣品10 mg 于0.5 mL 氘代DMSO 中充分溶解，并于石英核磁管中進(jìn)行11B NMR 掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 數(shù)據(jù)處理軟件，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。采用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源性硼酸在腐竹加工過(guò)程中的遷移行為

圖2為外源性硼酸在腐竹加工過(guò)程中的遷移行為。從圖中可以看出，腐竹中總硼含量隨外源性硼酸添加量的增加而增加，并在外源性硼酸添加量為20%時(shí)趨于飽和。表明外源性硼酸在大豆制品加工過(guò)程中能夠順利遷移至腐竹中，且有較高的遷移率，進(jìn)而改善腐竹品質(zhì)，從側(cè)面證明外源性硼酸與腐竹中某些物質(zhì)反應(yīng)生成硼酸酯類化合物。

2.2 Sephadex G50 分離硼酸及其復(fù)合物

圖2 外源性硼酸在腐竹中的遷移行為Fig.2 Boron contents of yuba with different additional boric acid contents

2.2.1 Sephadex G50 對(duì)硼酸標(biāo)準(zhǔn)液的分離效果交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex gel）是一種含有羥基的交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)，具有多孔性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。雖然Sephadex 不含有順式二醇羥基，但這種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中羥基排列以及Sephadex G50 合適的孔徑大小，提供了硼酸與其可逆性結(jié)合的可能性，使硼酸在適合的pH 值和洗脫流速條件下，在固定的體積中被集中的洗脫出來(lái)。圖3為Sephadex G50 對(duì)不同濃度的硼酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分離富集的結(jié)果?？梢钥闯?，隨著標(biāo)準(zhǔn)硼酸液濃度的變化硼酸均從640～650 mL 體積開(kāi)始被洗脫出來(lái)，并在690～700 mL 達(dá)到峰值，750～760 mL 洗脫完畢，即硼酸洗脫體積在640～760 mL 之間，其回收率為103%～107%。說(shuō)明Sephadex G50對(duì)硼酸的洗脫體積較為穩(wěn)定，且有較高的回收率。

2.2.2 Sephadex G50 對(duì)果糖硼酸復(fù)合物分離效果 果糖含有鄰羥基，易與硼酸結(jié)合生成果糖硼酸二酯。由于Sephadex G50 具有多孔性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及適當(dāng)尺寸孔徑，與硼酸可逆結(jié)合形成不穩(wěn)定的硼酸酯單酯，導(dǎo)致硼酸被延遲洗出，而果糖硼酸二酯先于硼酸洗出，從而使硼酸與果糖硼酸二酯被分離開(kāi)來(lái)。將果糖與硼酸混合反應(yīng)后利用Sephadex G50 分離，結(jié)果如圖4所示。信號(hào)峰A 的洗脫體積為500～640 mL，信號(hào)峰B 的洗脫體積為640～730 mL，對(duì)比硼酸標(biāo)準(zhǔn)液洗脫體積，信號(hào)峰B 的洗脫體積與硼酸標(biāo)準(zhǔn)液基本一致，信號(hào)峰A 物質(zhì)早于信號(hào)峰B 物質(zhì)被洗脫出來(lái)。由此可知，信號(hào)峰A 為果糖硼酸二酯（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4），信號(hào)峰B 為硼酸。總硼回收率為98.10%，說(shuō)明Sephadex G50 對(duì)硼酸及硼酸酯類化合物有較好的分離效果。

圖3 Sephadex G50 分離硼酸標(biāo)準(zhǔn)液Fig.3 Elution diagrams of boric acid standard solution

圖4 Sephadex G50 分離果糖硼酸混合溶液Fig.4 Elution diagrams of fructose and boric acid solution

2.2.3 Sephadex G50 對(duì)腐竹中硼酸及其復(fù)合物的分離 鑒于Sephadex G50 對(duì)硼酸標(biāo)準(zhǔn)液及硼酸酯類化合物的特異性，利用其對(duì)腐竹中的硼酸及硼酸酯類化合物進(jìn)行分離。根據(jù)Sephadex G50 的特性可知，硼酸酯類化合物早于硼酸洗出。添加5%，10%，15%，20%，30%外源性硼酸的腐竹中硼物質(zhì)的形態(tài)分布如圖5所示。從圖中可以看出，添加5%，10%，15%外源性硼酸的腐竹其總硼在體積為490～780 mL 之間被完全洗出，其總硼回收率為97%～112%。對(duì)比硼酸標(biāo)準(zhǔn)液，硼酸標(biāo)準(zhǔn)液的洗脫體積為640～760 mL 之間，腐竹樣品有相對(duì)較寬的洗脫體積范圍且有較早的出峰體積，在F1處均出現(xiàn)肩峰（圖5中紅色圓圈處），且洗脫完畢體積基本一致。結(jié)果表明：F1為硼復(fù)合物，F(xiàn)2為硼酸。F1與F2處總硼含量見(jiàn)表1。添加20%，30%外源性硼酸的腐竹中，其洗脫峰較為對(duì)稱且沒(méi)有肩峰，而在樣品上樣前添加一定量的硼酸（分別添加125，1 000 μg 硼酸），其洗脫結(jié)果出現(xiàn)肩峰，這是因?yàn)橥饧拥呐鹚岽蠖嘣隗w積640～760 mL 洗出，不會(huì)在640 mL 體積之前洗出，從而使硼酸酯類化合物的信號(hào)峰凸顯出來(lái)。

由此可知，在腐竹的加工過(guò)程中，外源性硼酸與腐竹中含有鄰羥基的物質(zhì)相結(jié)合形成穩(wěn)定的硼復(fù)合物，而大部分的外源性硼酸在腐竹中以硼酸的形式存在。Sephadex G50 未能將腐竹中硼復(fù)合物和硼酸完全分離開(kāi)來(lái)的原因可能是：（1）腐竹中復(fù)雜的成分對(duì)分離造成了干擾；（2）該硼復(fù)合物在該分離條件下受到一定程度的破壞；（3）游離硼酸所占比例較大，復(fù)合態(tài)硼所占比例較小，不利于將兩者分離開(kāi)來(lái)。

圖5 不同外源性硼酸添加量的腐竹中硼形態(tài)分布Fig.5 Distribution of different forms of boron in yuba samples treated with different amount of extrinsic boron

表1 硼酸及硼復(fù)合物在不同腐竹樣品中的含量Table1 Boric acid and boron complex content in different yuba samples

2.3 11B NMR 圖譜分析

Sephadex G50 未能將腐竹體系中硼酸及硼酸酯類化合物完全分離開(kāi)來(lái)，然而由于肩峰的出現(xiàn)也證明了硼酸酯類化合物的存在。因此，本研究利用11B NMR 進(jìn)一步鑒定外源性硼酸在腐竹中的形態(tài)分布。圖6分別為11B NMR 掃描樣品0%腐竹，5%腐竹，10%腐竹，15%腐竹，20%腐竹，30%腐竹的結(jié)果。NMR 分析中，不同形態(tài)的硼在11B NMR 圖譜上的化學(xué)位移不同，不同信號(hào)峰的積分面積之比等于不同形態(tài)硼含量之比，因此，可以通過(guò)計(jì)算11B NMR 圖譜中不同信號(hào)峰面積比例確定各硼化合物含量之比。

從圖6可以看出，樣品10%，15%，20%和30%腐竹，均顯示有3 種硼信號(hào)峰，而5%腐竹僅在20 ppm 處有一個(gè)較小的信號(hào)峰，這是由核磁掃描靈敏度較低所致。各信號(hào)峰化學(xué)位移見(jiàn)表2，信號(hào)峰a 為硼酸，信號(hào)峰b 為硼酸單酯，信號(hào)峰c 高度對(duì)稱為硼酸二酯。結(jié)果表明，在腐竹加工過(guò)程中，外源性硼酸確實(shí)和大豆中某些含有鄰羥基的物質(zhì)相互結(jié)合。

圖6 11B NMR 掃描不同外源性硼酸添加量的腐竹Fig.6 11B NMR spectra of different additional boric acid contents in yuba

腐竹中各信號(hào)峰積分面積之比見(jiàn)表3。從表3可以得出，外源性硼酸在腐竹中約84.7%～93.5%以游離硼酸形式存在，約6.5%～15.3%以復(fù)合態(tài)硼存在，且其比例與表1中各樣品F1/F2值基本一致，即與Sephadex G50 分離結(jié)果一致。

表2 腐竹中11B NMR 信號(hào)峰化學(xué)位移Table2 The 11B NMR chemical shift of yuba

表3 腐竹中11B NMR 各信號(hào)峰積分面積比值Table3 The ratio of 11B NMR signal peak integral area of yuba

3 結(jié)論

在腐竹加工過(guò)程中，添加不同量的外源性硼酸，其在腐竹中的遷移量隨外源性硼酸添加量的增加而增加，說(shuō)明外源性硼酸能夠順利遷移至腐竹且有較高的遷移率，進(jìn)而改善腐竹品質(zhì)。這一結(jié)果從側(cè)面證明外源性硼酸與腐竹中某些物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。

利用Sephadex G50 對(duì)腐竹中硼酸及硼酸酯類化合物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)硼酸標(biāo)準(zhǔn)液有較寬的洗脫體積范圍，并且在硼酸標(biāo)準(zhǔn)溶液洗脫體積之前均出現(xiàn)了肩峰，說(shuō)明外源性硼酸在腐竹中并非完全以硼酸形式存在，硼酸在遷移過(guò)程中形成了硼復(fù)合物。這一結(jié)論為理清大豆制品腐竹加工過(guò)程中內(nèi)、外源性硼的關(guān)系提供了重要參考，也為全面評(píng)估外源性硼對(duì)人體的危害性提供了新思路。

最后，本研究利用11B NMR 進(jìn)一步鑒定外源性硼酸在腐竹中的形態(tài)分布。11B NMR 圖譜中顯示外源性硼酸在腐竹中主要以3 種形態(tài)存在，分別為硼酸、硼酸單酯、硼酸二酯，約84.7%～93.5%以硼酸形式存在，約6.5%～15.3%以硼酸單酯和硼酸二酯的形式存在，且這一結(jié)論與Sephadex G50分離結(jié)果基本一致。這一研究成果為開(kāi)發(fā)具有良好生物活性的食源性硼復(fù)合物提供了重要價(jià)值。