調(diào)味面制品中蠟樣芽胞桿菌污染狀況調(diào)查分析

季小榮 劉欽鈺 陳曉蔚

（江蘇產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 江蘇南京 210007）

1 前言

蠟樣芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬中的一種革蘭氏陽性桿菌，廣泛分布于空氣、土壤和食品等環(huán)境中。當(dāng)食品中蠟樣芽胞桿菌菌量大于105CFU/g 時，會產(chǎn)生毒素，引起嘔吐和腹瀉。因此，人們也越來越關(guān)注食品中蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒[1]。

QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)由MALDI-TOF質(zhì)譜儀和微生物數(shù)據(jù)庫組成。其工作原理是，將微生物樣品和基質(zhì)液點(diǎn)樣到靶板上，當(dāng)激光轟擊時，基質(zhì)吸收能量轉(zhuǎn)移到微生物樣品，并提供質(zhì)子給樣品，使樣品離子化，通過飛行時間后，質(zhì)量分離器將樣品中的蛋白質(zhì)根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）分離，得到樣品的蛋白指紋圖譜。通過與基于微生物核糖體蛋白和部分具有微生物種屬特征的結(jié)構(gòu)蛋白的QuanID 菌種數(shù)據(jù)庫比對，獲得鑒定結(jié)果[2]。

調(diào)味面制品，俗稱辣條，具有“高鹽、高油、高添加”的特點(diǎn)。由于其口感豐富，價格低廉，吸引了大量的消費(fèi)者，因此，其產(chǎn)品質(zhì)量顯得尤為重要[3]。本次研究是對調(diào)味面制品中蠟樣芽胞桿菌的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查分析，通過調(diào)查分析來及時發(fā)現(xiàn)調(diào)味面制品中存在的問題，確保食品安全，為以后食品監(jiān)測管理提供一定數(shù)據(jù)支撐。另外，通過QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對蠟樣芽胞桿菌的生化鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時，比較蠟樣芽胞桿菌兩種鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為快速鑒定蠟樣芽胞桿菌提供了依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)備

生化培養(yǎng)箱；QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)；電子天平；高壓蒸汽滅菌鍋；顯微鏡。

2.2 樣品來源

從超市購買了300 批次調(diào)味面制品。

2.3 培養(yǎng)基和試劑

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（MYP）；胰酪胨大豆多黏菌素肉湯；營養(yǎng)瓊脂；胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂；蠟樣芽胞桿菌生化鑒定試劑盒。

2.4 蠟樣芽胞桿菌計(jì)數(shù)方法

GB 4789.14—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（MPN 計(jì)數(shù)法）。

2.5 實(shí)驗(yàn)過程

2.5.1 樣品制備

稱取樣品25 g，放入盛有225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)拍打1～2 min。

2.5.2 樣品接種

取3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種于10 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3 管，每管接種1 mL（如果接種量需要超過1 mL，則需要用雙料胰酪胨大豆多黏菌素肉湯），于30℃培養(yǎng)48 h。

2.5.3 培養(yǎng)

用接種環(huán)從各管中分別移取1 環(huán)，劃線接種到MYP 瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)24 h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24 h 再觀察。在MYP 瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。

2.5.4 純培養(yǎng)

從MYP 平板上挑取典型菌落，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。在營養(yǎng)瓊脂上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃或融蠟狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)睿睆綖?4～10 mm。

2.5.5 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的單個菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)、動力試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪蛋白分解試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、葡萄糖利用（厭氧）試驗(yàn)、根狀生長試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。

2.5.6 結(jié)果與報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數(shù)，查MPN 檢索表，報(bào)告每克樣品中蠟樣芽胞桿菌的最可能數(shù)，以MPN/g 表示。

2.5.7 QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)微生物鑒定

挑取單菌落，將單菌落涂在靶板上，添加稀釋劑及基質(zhì)，然后上機(jī)鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 生化鑒定結(jié)果

挑取的典型菌落進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果達(dá)到預(yù)期生化鑒定結(jié)果，具體生化鑒定結(jié)果詳見表1所示。

表1 蠟樣芽胞桿菌生化鑒定結(jié)果

蠟樣芽胞桿菌生化鑒定項(xiàng)目較多，操作煩瑣，成本高，對實(shí)驗(yàn)人員要求較高，檢測周期長，大部分生化鑒定需要24～48 h，蛋白質(zhì)毒素晶體鑒定周期長達(dá)一周。

3.2 QuanID微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

根據(jù)圖1發(fā)現(xiàn)，鑒定菌株的質(zhì)譜峰與QuanID數(shù)據(jù)庫中蠟樣芽胞桿菌菌株蛋白，表明鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌。根據(jù)驗(yàn)證，生化鑒定結(jié)果與QuanID微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果保持一致。

圖1 蠟樣芽胞桿菌鑒定圖譜

3.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

通過查找MPN 檢索表，具體檢測數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

300 批次調(diào)味面制品中，共有28 批次檢出蠟樣芽胞桿菌，其檢出率為9.33%?？紤]到調(diào)味面制品的滲透壓高，雖然污染了蠟樣芽胞桿菌，但繁殖較慢，所以，檢出蠟樣芽胞桿菌樣品的MPN 值相對較低?？梢钥闯觯{(diào)味面制品中蠟樣芽胞桿菌污染菌量相對不高，沒有達(dá)到引起食物中毒的菌量程度，說明調(diào)味面制品的食品安全情況較好。檢出蠟樣芽胞桿菌的調(diào)味面制品污染源可能是由于原料和生產(chǎn)環(huán)節(jié)沒有采取相關(guān)必要措施。

表2 蠟樣芽胞桿菌檢測結(jié)果

4 結(jié)語

通過調(diào)查分析，調(diào)味面制品中，蠟樣芽胞桿菌污染存在，但菌量相對較輕，沒有達(dá)到食物中毒的菌量，但人們還仍需提高警惕。因?yàn)橄灅友堪麠U菌為條件致病菌，一旦有較適宜的生長條件就會大量繁殖引起食物中毒，且大多無腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，感官性狀正常[4]。所以，需將蠟樣芽胞桿菌作為微生物監(jiān)測的常檢項(xiàng)目，定期對調(diào)味面制品中的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行監(jiān)測，保障食品安全。食品企業(yè)還需加強(qiáng)對原材料和生產(chǎn)環(huán)節(jié)的監(jiān)管，提高生產(chǎn)人員的食品安全意識。一般而言，有部分蠟樣芽胞桿菌會帶有致病性的毒力基因，所以，在以后的監(jiān)測過程中，需要輔助監(jiān)測攜帶毒力基因情況，才能更全面地了解食品中蠟樣芽胞桿菌的污染情況。

目前，蠟樣芽胞桿菌的檢測方法，仍以國標(biāo)的生化培養(yǎng)法為主。該方法檢測周期長，需要操作人員有豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。而QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定蠟樣芽胞桿菌相對于國標(biāo)生化鑒定具有較大優(yōu)勢，能夠簡化操作，縮短檢測周期，節(jié)約成本等。因此，通過進(jìn)一步研究QuanID 微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定方法，可以為快速檢測蠟樣芽胞桿菌等致病菌提供技術(shù)手段。