長鏈非編碼RNA Hotair通過調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與侵襲

李燕 周雄坤 劉靜 茍亞軍

胃癌作為全球第二大惡性腫瘤，每年有超過100萬的新發(fā)病例[1]。由于飲食習(xí)慣的問題，中國是胃癌的高發(fā)國家，2017年有近70萬新發(fā)病例，且大部分患者診斷時已為進(jìn)展期胃癌，易侵襲轉(zhuǎn)移，死亡率較高[2]。胃癌早期癥狀不明顯，因此尋找胃癌的特異性診斷標(biāo)志物并探究其機(jī)制對于胃癌的治療、診斷具有重要意義。

越來越多的研究表明，lncRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用，其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[3]。已經(jīng)有文獻(xiàn)表明，一系列l(wèi)ncRNA能夠調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)通路，甚至可以作為預(yù)后評價標(biāo)志物或者治療靶點[4]。巨噬細(xì)胞是許多腫瘤的重要細(xì)胞成分，一般將這種巨噬細(xì)胞命名為腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞或癌支持巨噬細(xì)胞，有研究表明其對于腫瘤的發(fā)展有促進(jìn)作用[5-7]。有研究表明，lncRNA Hotair在胰腺癌中表現(xiàn)出促癌性質(zhì)，與預(yù)后較差相關(guān)[8]。本研究，發(fā)現(xiàn)胃腺癌細(xì)胞能夠通過lncRNA Hotair將腫瘤中的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┲С志奘杉?xì)胞，并且局促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與侵襲，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展，有可能為胃腺癌的早期診斷與治療提供新的靶點。

材料與方法

一、實驗材料

1.組織樣本：從陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015至2017年住院的胃腺癌患者中隨機(jī)選出30 例納為本次研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟、肺功能不全；（2）合并感染、腫瘤、免疫性疾??；（3）合并血液系統(tǒng)疾病。該研究通過了西南醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理號：20151024），所有患者都簽署了知情同意書。所有組織在切除后立即冰凍并保存于-80℃，以備進(jìn)一步實驗。

2.細(xì)胞系：AGS人胃腺癌細(xì)胞（北京北納生物公司）。

3.實驗試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Sigma公司），胎牛血清（美國Gibco公司），Lipofectamine 2000（美 國 Invitrogen 公 司），IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 與 IL-10 ELISA 試劑盒，Hotair質(zhì)粒與siRNA（中國吉瑪基因公司）。

4.實驗動物：3月齡SD大鼠來自陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。

二、實驗方法

（一）胃癌細(xì)胞系培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

AGS人胃腺癌細(xì)胞購自北京北納生物公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境37℃，含5% CO2。使用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑，lncRNAHotair或干擾RNA以50 nmol/L的濃度加入每孔細(xì)胞。Hotair特異性引物為：上游：5'-CATG GATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3'；下 游：5'-ACTCTCGAGCCACCACACACACACAA CCTACAC-3'。HotairsiRNA序列為：5'-GCGCCUUCC UUAUAAGUAUTT-3'。Hotair質(zhì)粒與 siRNA都由吉瑪基因合成。細(xì)胞分為空白對照組、Hotair過表達(dá)組與RNA干擾組。

（二）巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞從大鼠腹腔中提取。首先將含有青霉素和鏈霉素的PBS溶液注射入SD大鼠腹腔并揉搓腹部，2 min后從腹部抽取出液體并以300×g轉(zhuǎn)速離心5 min。隨后細(xì)胞重懸于紅細(xì)胞裂解液中2 min。再次離心后將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，3 h后去除沒有貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每2天更換1次。

（三）共培養(yǎng)實驗

巨噬細(xì)胞與AGS人胃腺癌細(xì)胞的共培養(yǎng)實驗使用Transwell小室完成。對照組為：巨噬細(xì)胞以1×105個/孔的密度加入 24 孔 Transwell板上室（孔徑0.4 μm），AGS細(xì)胞組在對照組基礎(chǔ)上，AGS細(xì)胞以同樣密度加入下室，共培養(yǎng)3 d，進(jìn)行后續(xù)檢測。

（四）指標(biāo)檢測

1.細(xì)胞侵襲實驗：使用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室測定AGS細(xì)胞的侵襲遷移能力。加100 μl無血清培養(yǎng)基AGS細(xì)胞懸液至Transwell上室，600 μl培養(yǎng)基（10%血清）加入下室。24 h后取出小室，PBS溶液洗滌后甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，鏡下觀察。

2.細(xì)胞增殖檢測：使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。各組的AGS細(xì)胞貼壁于96孔板并培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定459 nm處吸光度。

3.細(xì)胞免疫熒光染色：各組巨噬細(xì)胞種植于細(xì)胞爬片，使用4 %多聚甲醛固定后，CD86一抗4 ℃孵育過夜。隨后使用Alexa Fluor 568標(biāo)記的二抗室溫染色1 h。使用同樣的方法標(biāo)記細(xì)胞表面CD206。最后使用蔡司熒光顯微鏡觀察拍照。

4.胃癌組織原位雜交實驗：對于石蠟包埋的胃癌組織切片，首先使用10 mmol/L的檸檬酸溶液煮沸10 min修復(fù)抗原，使用Triton X-100透膜。使用濃度為2 ng/μl熒光標(biāo)記的HotaircDNA探針溶液孵育24 h。隨后使用CD206抗體對巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，以進(jìn)行巨噬細(xì)胞與lncRNA Hotair的共定位。

5.酶聯(lián)免疫吸附測定：在96孔板細(xì)胞生長至數(shù)量為5×105個之后，使用ELISA實驗檢測各項炎癥相關(guān)因子的水平。首先使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制各個因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取上清液，按照雙抗夾心法實驗步驟進(jìn)行IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 與 IL-10 濃度檢測。

6.流式細(xì)胞術(shù)：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。各組細(xì)胞使用APC標(biāo)記的CD86抗體與FITC標(biāo)記的CD206抗體進(jìn)行染色。染色完成后每組取約1×105個細(xì)胞重懸于100 μl流式緩沖液中，使用Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

7. RNA提取與定量RT-PCR：使用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA。使用cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈。隨后使用SYBR Green I染料在CFX Connect熒光定量PCR檢測系統(tǒng)中進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH做歸一化處理。引物序列如下：GAPDH上游引物：5'-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3'，下游：5'-ATTCGGAGAAGGGAGGGCT-3'；PICSAR：上 游：5'-TGCCTGGACTTTCAAGAGGTAA-3'，下游：5'-GCTCTCAGTCAGCAGACACTT-3'。

8.細(xì)胞增殖檢測：使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。Transwell上室AGS細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)48 h后，每孔加入30 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，細(xì)胞數(shù)量、吸光度值、RNA含量等指標(biāo)以x± s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胃腺癌細(xì)胞將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗炎型癌支持細(xì)胞

為了確定胃腺癌細(xì)胞對鄰近巨噬細(xì)胞的影響，本研究進(jìn)行了共培養(yǎng)實驗，AGS胃腺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)于Transwell板中。3 d后使用免疫熒光染色檢測CD206與CD86陽性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，AGS細(xì)胞組中，CD206陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量（32.51±5.44）個多于對照組（5.63±1.97）個，而CD86陽性細(xì)胞數(shù)量降低，表明實驗組中更多的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┲С旨?xì)胞（圖1、表1）。

表1 兩組巨噬細(xì)胞不同表型數(shù)量（個，± s）

表1 兩組巨噬細(xì)胞不同表型數(shù)量（個，± s）

分組 樣本量 CD86 CD206對照組 3046.82±7.455.63±1.97 AGS 細(xì)胞組 307.86±2.4432.51±5.44 t 值 27.46425.742 P值 0.0010.001

隨后的ELISA實驗也印證了這一結(jié)論，AGS細(xì)胞組巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6三種炎性因子水平降低，而TGF-β、IL-4和IL-10三種抗炎因子水平升高（表2）。

二、胃腺癌細(xì)胞通過長鏈非編碼RNA Hotair作用于巨噬細(xì)胞

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察兩組胃腺癌細(xì)胞對鄰近巨噬細(xì)胞的影響（免疫熒光染色，×400）

表2 兩組炎癥相關(guān)因子水平檢測（pg/ml，± s）

表2 兩組炎癥相關(guān)因子水平檢測（pg/ml，± s）

分組 樣本量 IL-6 TNF-α IL-1β TGF-β IL-4 IL-10對照組 30986.51±239.132986.43±731.21567.92±143.4787.32±19.2449.94±17.5698.82±46.26 AGS 細(xì)胞組 30321.63± 96.32998.34±314.73212.41±101.24163.45±54.91156.83±69.25385.65±24.75 t 值 14.13613.68011.0947.1678.20329.991 P值 0.0010.0010.0010.0010.0010.001

本研究首先從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出胃癌組織與鄰近正常組織表達(dá)差異最大的兩種lncRNA：lncRNA Hotair與lncRNA PICSAR。AGS細(xì)胞組采用巨噬細(xì)胞與AGS細(xì)胞共培養(yǎng)于Transwell小室的方案，對照組去除下室的AGS細(xì)胞，采用相同的培養(yǎng)基。隨后進(jìn)行RT-PCR實驗檢測共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞內(nèi)兩種lncRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞內(nèi)lncRNA Hotair水平高于對照組，而lncRNA PICSAR與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。隨后的原位雜交實驗結(jié)果表明，胃癌組織中的CD206陽性巨噬細(xì)胞與Hotair有較強(qiáng)相關(guān)性，其中紅色為CD206，綠色為Hotair定位，兩者能夠共定位（圖2）。

表3 巨噬細(xì)胞兩種lncRNA相對水平檢測

三、長鏈非編碼RNA Hotair將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┲С旨?xì)胞

首先檢測了轉(zhuǎn)染Hotair質(zhì)粒的Hotair過表達(dá)組或轉(zhuǎn)染Hotair siRNA的RNA干擾組中AGS細(xì)胞Hotair相對含量，Hotair過表達(dá)組的Hotair相對含量為0.78±0.12，高于對照組的0.39±0.06（P＜ 0.05），而 RNA 干 擾 組 的 Hotair含 量 降 低（0.14±0.02，P＜ 0.01），表明轉(zhuǎn)染成功。隨后使用流式細(xì)胞儀對各組AGS細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的巨噬細(xì)胞表型進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，相對于對照組，Hotair過表達(dá)組中含有更多的CD206陽性細(xì)胞，而RNA干擾組CD86陽性細(xì)胞更多（圖3，表4）。

隨后，巨噬細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Hotair質(zhì)粒或Hotair siRNA后與AGS細(xì)胞共培養(yǎng)，Transwell上室包被了Matrigel，以驗證AGS細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力。實驗結(jié)果表明，Hotair過表達(dá)組視野內(nèi)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（326.90±34.62）個，高于對照組（174.81±24.24）個，（P＜ 0.01），而 RNA 干擾組細(xì)胞侵襲數(shù)量為（126.78±21.85）個，相比對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，表4）。轉(zhuǎn)染了Hotair質(zhì)粒的細(xì)胞增殖能力顯著高于未轉(zhuǎn)染的對照組；相反，轉(zhuǎn)染siRNA之后細(xì)胞增殖能力則顯著降低（P＜0.01，表4）。

討 論

中國是胃癌的高發(fā)國家，且大部分患者診斷時已為進(jìn)展期胃癌，死亡率較高。胃癌早期癥狀不明顯，因此尋找胃癌的特異性診斷標(biāo)志物并探究其機(jī)制對于胃癌的治療、診斷具有重要意義[9]。

圖3 Hotair將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┲С旨?xì)胞

表4 各組流式細(xì)胞各表型細(xì)胞比例、450 nm吸光度與侵襲細(xì)胞數(shù)量

局部微環(huán)境對于腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移有重要作用，腫瘤細(xì)胞通過多種方式改變周圍環(huán)境從而有利于自身發(fā)展[10]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞近些年受到關(guān)注，巨噬細(xì)胞原本為促炎M1表型，但腫瘤中的巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譓2表型的癌支持細(xì)胞，從而有利于腫瘤的增殖[11]。長鏈非編碼RNA是腫瘤細(xì)胞影響周圍環(huán)境的重要方式之一，本研究假設(shè)胃癌細(xì)胞可能通過lncRNA作用于巨噬細(xì)胞從而改變其表型。

首先，本研究通過共培養(yǎng)實驗，驗證了巨噬細(xì)胞會在AGS細(xì)胞作用下，由CD86促炎型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D206抗炎細(xì)胞，ELISA實驗也表明，與共培養(yǎng)AGS細(xì)胞共培養(yǎng)組的巨噬細(xì)胞分泌更少的促炎因子，更多的抗炎因子，進(jìn)一步證明巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。為了選出起到這一作用的關(guān)鍵lncRNA，首先從GEO數(shù)據(jù)庫篩選出胃癌細(xì)胞與周圍正常組織表達(dá)差異最大的兩種lncRNA：Hotair與PICSAR。本研究測定共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞內(nèi)兩種lncRNA的含量，結(jié)果表明實驗組中Hotair水平與對照組有顯著差別，而PICSAR無顯著差別，表明Hotair可能是起到這一關(guān)鍵作用的lncRNA。于是本研究對AGS進(jìn)行Hotair轉(zhuǎn)染與RNA干擾實驗，證明了敲低Hotair水平會抑制巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，Hotair轉(zhuǎn)染則相反。對臨床樣本進(jìn)行的共定位實驗也表明，Hotair與CD206陽性細(xì)胞密切相關(guān)。為了驗證表型轉(zhuǎn)換之后的巨噬細(xì)胞對AGS細(xì)胞功能的影響，在巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染Hotair或HotairsiRNA后與AGS細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明Hotair組的AGS細(xì)胞增殖與侵襲能力顯著增強(qiáng)，HotairssiRNA組則正好相反。

總而言之，本研究證明了胃癌細(xì)胞通過lncRNAHotair促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的炎性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡装┲С旨?xì)胞，從而促進(jìn)胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移，為胃癌治療提供了可能的新靶點。