hUC-MSCs下調(diào)HIF-1α及VEGF表達(dá)對(duì)NAFLD大鼠肝臟損傷的作用

王文清 易文城 林擁華

非酒精性脂肪性肝?。╪on alcohol fatty liver disease，NAFLD）是指肝臟內(nèi)脂肪浸潤(rùn)超過(guò)5%，排除過(guò)量飲酒、自身免疫、病毒感染和藥物性損傷的疾病。近年NAFLD發(fā)病率呈持續(xù)攀升趨勢(shì)，已成為繼慢性病毒性肝炎危害公共健康的第二大肝病[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor-1，HIF- 1α）是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在機(jī)體缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性作用的重要調(diào)節(jié)因子，能夠與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等 靶基因中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)控機(jī)體各組織缺氧預(yù)適應(yīng)。已有研究證實(shí)HIF-1α調(diào)控VEGF信號(hào)通路與機(jī)體諸多組織損傷中的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]，但其對(duì)NAFLD肝組織損傷的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)高糖高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠建立NAFLD模型，探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）介導(dǎo) HIF-1α/VEGF 通路對(duì)NAFLD肝臟結(jié)構(gòu)及功能的影響。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：21只5周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司訂購(gòu)，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定的環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2. hUC-MSCs：本實(shí)驗(yàn)選用第 3 ～ 7 代 hUCMSCs。剪取足月產(chǎn)婦臍帶基質(zhì)組織塊制備hUC- MSCs，膠原酶Ⅳ消化組織塊，取懸液，離心、萃取，沉淀，胰蛋白酶消化，過(guò)濾，取細(xì)胞濾液，離心、細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種、常規(guī)培養(yǎng)及傳代均選用無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基。

二、方法

1.動(dòng)物分組及干預(yù)：21只大鼠隨機(jī)分為7只正常對(duì)照組（NC組）和14只NAFLD造模組。正常組大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周。14只造模大鼠再次隨機(jī)分為NAFLD模型對(duì)照組（MC組）；hUC-MSCs治療組（MC+hUC-MSCs組）；兩組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料，其中，MC+hUC-MSCs組每?jī)芍芪察o脈注射含 hUC-MSCs數(shù)目為 10×106個(gè)的培養(yǎng)液 100 μl，共干預(yù)8周。NC組和MC組同期尾靜脈注射不含hUC-MSCs培養(yǎng)液 100 μl。

2.一般指標(biāo)觀察、采集血清和肝臟組織標(biāo)本：密切觀察并記錄大鼠飲食情況、精神狀及活動(dòng)狀態(tài)和體重等一般狀況；各組大鼠干預(yù)8周處死，留取血清標(biāo)本及肝臟組織標(biāo)本并按適宜方法保存。肝指數(shù)（%）=（肝濕重／體重）×100%。

3.血清指標(biāo)檢測(cè)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、空腹血糖（FPG）和空腹胰島素（FINS）；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5（FPG：mmol/L，F(xiàn)INS：mU/L）。

4. HE染色光鏡觀察大鼠肝臟組織形態(tài)：按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組2011年制定的NAFLD活動(dòng)度積分（NAS）評(píng)估指南，對(duì)各組大鼠進(jìn)行NAS評(píng)定。NAS積分評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）肝細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪變性：0分（＜ 5%）；1分（5%～ 33%）；2分（34%～ 66%）；3分（＞ 66%）。（2）肝小葉內(nèi)炎癥程度（以20倍光鏡下計(jì)數(shù)壞死灶）：0分，無(wú)；1 分（＜ 2個(gè)）；2分（2 ～ 4個(gè)）；3分（＞4 個(gè)）。（3）肝細(xì)胞呈現(xiàn)氣球樣變性：0分，無(wú)；1分，少見(jiàn)；2分，多見(jiàn)。

圖1 光鏡下觀察各組大鼠治療8周肝臟組織病理改變（HE染色，×200）

5. Western Blot法檢測(cè)組織蛋白表達(dá)：取大鼠肝臟組織經(jīng)PBS漂洗，組織裂解液提取總蛋白，聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后加 VEGF抗體（1:1000）、抗 HIF-1α抗體（1:1000）、GAPDH（1:5000）過(guò)夜，TBCT漂洗再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育，TBGT漂洗，加入ECL暗室曝光，用Fluor-s凝膠系統(tǒng)分析蛋白條帶。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ALT、AST和HOMA-IR用x± s表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析選用pearson。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、比較各組大鼠治療8周ALT、AST和HOMA-IR

與 NC組比較，MC組大鼠 ALT、AST和HOMA-IR均升高（P＜ 0.05）；與MC組比較，MC+hUC-MSCs組大鼠ALT、AST和HOMA-IR均有不同程度的降低（P＜ 0.05，表1）。

表1 各組大鼠治療8周ALT、AST和HOMA-IR比較（± s）

表1 各組大鼠治療8周ALT、AST和HOMA-IR比較（± s）

注：與 NC 組比較，aP ＜ 0.01；與 MC組比較，bP ＜ 0.01

分組 鼠數(shù)（只）ALT（U/L） AST（U/L） HOMA-IR NC 組 741.1±5.951.7±5.21.93±0.22 MC 組 7153.9±7.1a169.8±15.9a23.20±2.63a MC+hUC-MSCs組 790.7±8.1ab110.0±13.1ab 8.43±1.39ab F值 445.03162.20280.40 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

二、比較各組大鼠治療8周肝臟組織病理改變及評(píng)定NAS積分

HE染色大鼠肝臟組織，光鏡下可見(jiàn)NC組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核大而圓，肝小葉呈放射狀排列；MC組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，較多細(xì)胞核變形或消失，肝小葉排列不齊伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；MC+hUC-MSCs組大鼠肝組織病理明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性程度減輕，脂滴空泡明顯減少，炎癥反應(yīng)減輕（圖1）。治療8周計(jì)算各組大鼠NAS積分顯示：與NC組比較，MC組大鼠NAS積分顯著增高；與MC組比較，MC+hUC-MSCs組大鼠NAS積分降低[（0.42±0.23）分vs（9.15±0.41）分、（5.15±0.29）分，P＜ 0.05]。

三、各組大鼠治療8周Western Blot法免疫組化法檢測(cè)肝臟組織HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)

與NC組比較，MC組大鼠HIF-1α和VEGF蛋 白 表達(dá) 均 增 高（P＜ 0.05）；與 MC 組 比 較，MC+hUC- MSCs組大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)均降低（P＜ 0.05）（圖 2，3）。

圖2 各組大鼠治療8周Western Blot法檢測(cè)肝臟組織VEGF、HIF-1α和GAPDH蛋白表達(dá)水平

圖3 各組大鼠治療8周Western Blot法檢測(cè)肝臟組織HIF- 1α和VEGF相對(duì)蛋白表達(dá)

四、相關(guān)分析

單因素相關(guān)分析顯示大鼠肝臟組織HIF-1α表達(dá)與大鼠膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及HOMA-IR指數(shù)均呈正相關(guān)（r值分別為0.783、0.751、0.837、0.892，P均 ＜ 0.05），而與高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)（r= -0.319，P＜ 0.05）。而且，大鼠肝臟組織NAS評(píng)分與肝臟組織HIF-1α、VEGF表達(dá)呈正相關(guān)（r值分別為 0.901、0.874，P均 ＜ 0.05），而大鼠肝臟組織HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.916，P＜ 0.05）。

討 論

目前NAFLD發(fā)病機(jī)制雖然尚未完全闡明，但經(jīng)典“兩次胰島素抵抗打擊”學(xué)說(shuō)依然是其致病的主要環(huán)節(jié)[6]，即首次胰島素抵抗打擊可造成肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，持續(xù)過(guò)量沉積的脂質(zhì)可進(jìn)一步加劇胰島素抵抗，進(jìn)而促使肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化[7]，因此，高糖高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠是近年研究NAFLD常用的較理想方法。本研究采用此造模方式，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致，觀察到NAFLD模型大鼠ALT、AST和HOMA-IR增高等肝功能異常，肝臟組織HE染色在光鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，較多細(xì)胞核變形或消失，肝小葉排列不齊伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及NAS積分增加等改變。

慢性缺氧可能是引起NAFLD的一個(gè)重要因子。HIF-1定位于細(xì)胞染色體14921-924，由兩個(gè)亞基α和β所組成，是細(xì)胞對(duì)氧濃度改變自適應(yīng)反應(yīng)中重要調(diào)節(jié)因子。其中HIF-1α發(fā)揮主要生物學(xué)作用。在常氧狀態(tài)下，通過(guò)蛋白的脯氨酰羥化和泛素化而降解；在缺氧條件下，泛素化水平被降解而增加HIF-1α表達(dá)，HIF-1α表達(dá)增多，在胞核中與HIF- 1β結(jié)合形成異二聚體即可與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[4]。研究認(rèn)為NAFLD存在兩次胰島素抵抗打擊，導(dǎo)致活性氧生成增多。一方面，抗氧化酶減少且活力下降，另一方面，氧化酶增多且活性增強(qiáng)，致使NAFLD肝臟組織氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化反應(yīng)損傷。此外，NAFLD因受胰島素抵抗打擊，還存在低度炎癥性反應(yīng)，NF-кB活性增加，NF-кB兩種亞基P50和P65均可識(shí)別并與HIF-1α啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)HIF-1α表達(dá)增加，活化缺氧反應(yīng)通路，使紅細(xì)胞攜氧能力下降，肝臟氧氣不易擴(kuò)散至組織中，毛細(xì)血管基底膜增厚，以及血液成分發(fā)生改變，從而致使NAFLD肝臟組織缺氧和缺血。此外，HIF-1α的上調(diào)會(huì)致使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF等促進(jìn)對(duì)誘使肝臟發(fā)生纖維化的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)。VEGF不僅能特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促使新生血管形成，而且能使內(nèi)皮血管間質(zhì)膠原酸表達(dá)，促進(jìn)肝臟纖維化發(fā)生[5]。本研究利用Western Blot法證實(shí)NAFLD大鼠肝臟組織HIF-1α和VEGF表達(dá)較正常大鼠明顯增加，相關(guān)關(guān)系分析還顯示肝臟HIF-1α和VEGF不僅與大鼠HOMA- IR評(píng)分呈正相關(guān)，而且大鼠肝臟組織NAS評(píng)分與肝臟組織HIF-1α、VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，大鼠肝臟組織HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。提示HIF-1α/VEGF通路與肝臟組織結(jié)構(gòu)、功能改變關(guān)系密切相關(guān)。

越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示干細(xì)胞具有維持機(jī)體器官組織炎癥免疫穩(wěn)態(tài)等多重作用。干細(xì)胞不僅能激活B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，而且能通過(guò)調(diào)控白細(xì)胞介素-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等多種炎癥因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體組織炎癥穩(wěn)態(tài)[6]。基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示hUC-MSCs可歸巢至受損的肝臟組織，分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，改善內(nèi)源性肝細(xì)胞再生、抑制凋亡，從而改善受損肝臟組織微環(huán)境[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞尚能通過(guò)減少白細(xì)胞介素表達(dá)和活性，降低P38促分裂原活性蛋白酶和C-Jun氨基末端激酶活化，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制肝細(xì)胞變性及凋亡從而改善CC4誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷[8]。此外，干細(xì)胞還具有旁分泌效應(yīng)而促進(jìn)肝細(xì)胞再生[9]。

在本研究中，經(jīng)hUC-MSCs治療8周NAFLD大鼠ALT、AST和HOMA-IR均降低，肝臟組織病理改變明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性程度減輕，脂滴空泡明顯減少，炎癥反應(yīng)減輕，NAS積分明顯降低。同時(shí)肝臟組織HIF-1α與VEGF的表達(dá)降低。而且相關(guān)關(guān)系分析顯示大鼠肝臟組織NAS評(píng)分與肝臟組織HIF-1α和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示hUC- MSCs通過(guò)下調(diào)HIF-1α/VEGF表達(dá)可能是保護(hù)NAFLD肝臟病變的作用機(jī)制之一。

綜上所述，對(duì)在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)hUC-MSCs對(duì)HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響，將對(duì)未來(lái)應(yīng)用hUC-MSCs防治NAFLD具有臨床應(yīng)用價(jià)值。