白細(xì)胞介素4降低臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對造血干細(xì)胞分化潛能的維持能力

郭冬陽 盧艷 岳影星 楊舟鑫

目前的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）可以從多種組織，如骨髓、脂肪、臍帶、羊膜、絨毛膜和牙髓等中分離得到。MSC可以向骨、脂肪、軟骨、肌腱和肌肉等中胚層來源的組織細(xì)胞分化[1]，因而在再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)中可能具有良好的應(yīng)用前景。目前對于骨髓MSC的研究比較全面和深入，而對臍帶MSC（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）的研究相對少一些。由于UC-MSC來源限制少，并且增殖能力強于骨髓MSC，因此對其的研究也越來越多[2]。

MSC增殖、分化、遷移和免疫調(diào)節(jié)功能會受到內(nèi)環(huán)境中多種因素的調(diào)節(jié)，很多免疫相關(guān)細(xì)胞因子如γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素1β和白細(xì)胞介素27等均具有調(diào)控MSC的能力[3-6]。白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）可以調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，參與體液免疫。目前對于IL-4調(diào)控MSC各種生物學(xué)特性的研究并不多。使用IL-4處理UC-MSC后，可以檢測到UC-MSC增殖能力的下降以及CD106 表達(dá)的上升；加入IL-4誘導(dǎo)的UC-MSC條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)臍血CD34+造血干細(xì)胞的分化，其作用可能與IL-4誘導(dǎo)UC-MSC的IL-6分泌有關(guān)[7-8]。

MSC一方面促進(jìn)造血干細(xì)胞分化，另一方面在維持造血干細(xì)胞分化潛能方面也有作用。為研究IL-4對MSC維持造血干細(xì)胞分化潛能的調(diào)節(jié)作用，本研究向UC-MSC和臍血造血干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入IL-4，然后研究其中造血干細(xì)胞數(shù)目及分化潛能的變化。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

DF12和IMDM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、2-巰基乙醇均為美國Gibico公司產(chǎn)品；胎牛血清、健馬血清購自美國Thermo scientif i c公司；CD34陽性分選試劑盒、MethoCult H4435培養(yǎng)基為加拿大Stemcell technologies公司產(chǎn)品；藻紅蛋白偶聯(lián)的CD11b、CD14、CD15，異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的CD34抗體以及同型對照抗體均為美國BD公司產(chǎn)品；白介素4細(xì)胞因子購買于Peprotech公司。倒置相差顯微鏡以及成像系統(tǒng)購買于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購買于美國BD公司產(chǎn)品。

二、主要實驗方法

1. UC-MSC培養(yǎng)：在獲得知情同意的情況下，收集足月妊娠的臍帶。用緩沖液沖洗臍帶后，剪碎臍帶之后用膠原酶和胰酶各消化30 min。用濾網(wǎng)過濾消化的產(chǎn)物從而去掉沒有消化完全的組織塊。將懸液離心后棄去上清液，加入含10%胎牛血清、100 U/ml青/鏈霉素的DF12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞生長到接近融合時，按照1 : 3的比例進(jìn)行傳代擴增。

2.臍帶血CD34+細(xì)胞分離：獲得知情同意的情況下，收集足月妊娠的臍血標(biāo)本。使用密度梯度離心的方法，分離臍血中的單個核細(xì)胞，并用PBS緩沖液清洗1遍。根據(jù)說明書的要求，使用CD34陽性分選試劑盒在磁珠分選器上分選出其中CD34+細(xì)胞。用含15%胎牛血清、15%健馬血清、100 U/ ml青（鏈）霉素的IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。

3. UC-MSC與臍血CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)：UC- MSC支持造血干細(xì)胞的體系參考文獻(xiàn)[2]。將培養(yǎng)的UC-MSC用絲裂霉素處理后，消化細(xì)胞，用DF12完全培養(yǎng)基把UC-MSC重懸。依照2×104個/ 孔把UC-MSC加入到24孔板。貼壁4 h后，更換為IMDM完全培養(yǎng)基，并加入2×104個CD34+細(xì)胞。置于37 ℃孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后更換一半培養(yǎng)基，在第14天收集細(xì)胞。對照組UC-MSC和CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)組；IL-4組在加入CD34+的同時加入含終濃度20 ng/ml的IL-4的IMDM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后更換的培養(yǎng)基也為含終濃度20 ng/ml的IL-4的IMDM完全培養(yǎng)基。

4.共培養(yǎng)后細(xì)胞集落培養(yǎng)：輕輕晃動孔板后，收集未與MSC黏附的懸浮細(xì)胞，取3×103的細(xì)胞與半固體培養(yǎng)基充分混合，加入到6孔板中，于37 ℃細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。在14 d后通過倒置顯微鏡計數(shù)其中≥50個細(xì)胞集落形成單位。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測收集細(xì)胞：對照組和IL-4組的細(xì)胞分別使用CD34或CD11b，CD14，CD15抗體標(biāo)記后15 min，用PBS清洗一遍后，用0.4 ml PBS重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞數(shù)量、共培養(yǎng)體系中細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成的集落形成單位數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)。以x± s表示，對照組與IL-4組間細(xì)胞數(shù)量和集落形成單位的差異比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、IL-4對UC-MSC與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)作用

UC-MSC與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)組與造血干細(xì)胞單獨培養(yǎng)組相比，細(xì)胞數(shù)量有很大的增加。加入IL-4（20ng/ml）后，鏡下可以觀察到共培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量較對照組有明顯下降（圖1）。收集細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，IL-4組的細(xì)胞數(shù)量（1.31±0.05）×105個/孔與對照組（2.80±0.28）×105個/孔相比顯著下降（t=7.31，P＜ 0.05，圖 2）。

二、IL-4處理對共培養(yǎng)體系中CD34+細(xì)胞比例的影響

用流式細(xì)胞儀分析IL-4組和造血干細(xì)胞單獨培養(yǎng)組共培養(yǎng)后的細(xì)胞中表達(dá)CD34的細(xì)胞的比例，對照組細(xì)胞CD34+細(xì)胞比例為6.21%，而IL-4組下降為2.50%，CD34+的造血干細(xì)胞比例有明顯的下降（圖3）。

三、 IL-4處理后共培養(yǎng)體系中細(xì)胞集落形成能力的變化

圖1 IL-4處理后UC-MSC與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞狀態(tài)

圖2 IL-4處理后UC-MSC與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞數(shù)量的影響

取共培養(yǎng)得到的細(xì)胞，在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 天后，倒置顯微鏡下觀察集落形成單位。兩組中形成的集落形成單位包括CFU-G（粒系集落形成單位）、CFU-M（巨噬系集落形成單位）、CFU-GM（粒-巨噬集落形成單位）、BFU-E（紅系爆式集落形成單位）、CFU-GEMM（粒紅單巨核集落形成單位）。其中。BFU-E和CFU-GEMM比例較少，主要以CFU-GM、CFU-G和CFU-M為主。如表1所示，細(xì)胞形成CFU-M的能力（9.33±1.53）個/孔較對照組（17.67±0.58）個 /孔有明顯下降（t= 8.84，P＜0.001；形成 CFU-GM 的能力（15.67±3.22）個/孔較對照組（29.33±4.04）個/孔有明顯下降（t=4.58，P＜ 0.05）；形成總集落形成單位的能力（39.33±9.07）個/孔較對照組（62.67±6.66）個/孔也有下降（t=3.59，P＜0.05），但 CFU-G 形成能力沒有明顯變化 [對照組：（13.33±3.22）個/孔；IL-4組（12.33±2.52）個/孔，t=0.42，P=0.69]。把分化得到的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)IL-4組得到的細(xì)胞分化出的細(xì)胞總數(shù)（3.67±1.71）×105個 / 孔與對照組（9.50±3.13）×105個/孔相比也明顯下降（t= 2.83，P＜ 0.05）。

表1 IL-4處理后共培養(yǎng)體系中細(xì)胞集落形成能力的變化（± s）

表1 IL-4處理后共培養(yǎng)體系中細(xì)胞集落形成能力的變化（± s）

分組 樣本數(shù) BFU-E CFU-G CFU-M CFU-GM CFU- GEMM 總集落形成單位 總細(xì)胞數(shù)（×105）對照組 31.00±1.0013.33±3.2217.67±0.5829.33±4.041.33±1.5362.67±6.669.50±3.13 IL-4 組 31.00±1.7312.33±2.529.33±1.5315.67±3.221.00±1.0039.33±9.073.67±1.71 t 值 0.000.428.844.580.323.592.83 P 值 0.990.69 ＜ 0.01 ＜ 0.050.77 ＜ 0.05 ＜ 0.05

圖3 IL-4處理對共培養(yǎng)體系中CD34+細(xì)胞比例的影響

四、 IL-4處理后共培養(yǎng)體系中細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞能力的變化

收集分化得到的細(xì)胞，其中CD11b+、CD14+和CD15+的細(xì)胞比例通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。如圖 4，IL-4組共培養(yǎng)后細(xì)胞分化成CD14+細(xì)胞的能力下降，而分化成的CD15+細(xì)胞比例上升。CD11b表達(dá)在髓系細(xì)胞上，巨噬細(xì)胞表達(dá)CD14，粒細(xì)胞表達(dá)CD15。因此，這一結(jié)果與集落形成實驗一樣，表明IL-4組的細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞的能力下降。

討 論

本研究在UC-MSC和造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中加入IL-4處理后，研究了IL-4對這一體系中造血干細(xì)胞分化潛能的影響。觀察到細(xì)胞數(shù)量減少以及CD34+細(xì)胞比例下降。這些細(xì)胞分化成的CFU-M和CFU-GM下降，分化成的細(xì)胞中CD14+細(xì)胞比例也下降，提示其分化成巨噬細(xì)胞的能力下降。IL-4組分化成的細(xì)胞中CD15+細(xì)胞比例有上升；但CFU-G沒有變化，CFU-GM下降，因此這些細(xì)胞分化粒細(xì)胞能力并沒有上升，只是由于巨噬細(xì)胞分化能力下降而導(dǎo)致的粒細(xì)胞比例相對上升。這些結(jié)果均說明加入IL-4后MSC對造血干細(xì)胞的維持能力下降。

課題組的另一項研究表明，IL-4處理的UC- MSC培養(yǎng)上清可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化，形成更多集落形成單位[7]。而在本研究，IL-4降低了UC-MSC對造血干細(xì)胞的維持作用。這可能是由于IL-4通過促進(jìn)UC-MSC分泌IL-6等細(xì)胞因子或直接作用于造血干細(xì)胞，使造血干細(xì)胞由能維持自身分化能力的不對稱分裂轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛳掠渭?xì)胞分化，造成造血干細(xì)胞的消耗。這兩組實驗采取了不一樣的體系，在本研究中使用的是共培養(yǎng)的體系，不同于單純使用上清的誘導(dǎo)分化體系。此外，本研究中IL-4一共持續(xù)處理了14 d，對UC-MSC的作用強度要遠(yuǎn)強于使用培養(yǎng)上清體系，IL-4的作用強度在MSC調(diào)控造血相關(guān)性質(zhì)過程中可能有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖4 IL-4處理對共培養(yǎng)體系中細(xì)胞分化成CD11b+、CD14+和CD15+細(xì)胞能力的影響

其他免疫相關(guān)細(xì)胞因子也可以調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞。I型輔助T細(xì)胞分泌的IFN-γ可以破壞小鼠動物模型中的造血干細(xì)胞，造成骨髓衰竭[9]。而IL-1β誘導(dǎo)的UC-MSC上清具有促進(jìn)CFU-G和CFU- GM的能力[10]。目前，MSC被認(rèn)為可被用于移植物抗宿主病和一些自身免疫性疾病的治療，并有相關(guān)臨床研究已經(jīng)表明MSC的治療效果[11-12]。這主要是由于MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能，在細(xì)胞因子等的調(diào)控下MSC可以釋放前列腺素E2等免疫調(diào)節(jié)因子從而抑制過激的炎癥反應(yīng)[13]。但在免疫系統(tǒng)激活的狀態(tài)下，也會引起UC-MSC造血相關(guān)基因表達(dá)的改變，從而影響體內(nèi)造血過程。因此，在使用UC-MSC治療免疫相關(guān)疾病時需要考慮炎癥反應(yīng)是否也會影響造血干細(xì)胞的功能。

總之，IL-4可以降低UC-MSC對造血干細(xì)胞的維持能力，尤其會降低向巨噬細(xì)胞的分化潛能。這一研究提示在Ⅱ型輔助T細(xì)胞相關(guān)體液免疫疾病中使用MSC治療時，也需要兼顧機體造血相關(guān)功能。