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    常見毛囊細(xì)胞角蛋白在毛囊周期中的表達(dá)研究

    2019-05-18 08:45:36燕榮帥裴卓馬小艮張一鳴李玉紅
    關(guān)鍵詞:母質(zhì)發(fā)育期角蛋白

    燕榮帥 裴卓 馬小艮, 張一鳴 李玉紅

    毛囊是具有周期性生長特性的一個(gè)特殊器官,在出生后,毛囊不斷經(jīng)歷生長期、退化期和靜止期的循環(huán)[1]。毛囊體積小,但結(jié)構(gòu)復(fù)雜??v切面觀察毛囊由外向里分為漏斗部、峽部、莖部和球部,與表皮呈一定角度;橫切面觀察毛囊由外向內(nèi)分為外根鞘、內(nèi)根鞘和毛干,呈同心圓排列。毛囊由十幾種細(xì)胞組成,除真皮乳頭和黑素細(xì)胞外,均來源于上皮細(xì)胞[2]。角蛋白在上皮細(xì)胞中表達(dá)最多,因此,角蛋白在毛囊的周期進(jìn)展中扮演著重要的角色。在人頭皮毛囊,有散在的角蛋白表達(dá)研究的報(bào)道,但是并未系統(tǒng)研究其在毛囊周期中的表達(dá)情況[3]。小鼠毛囊周期和人毛囊周期的最大差異,在于其同步化,即一定時(shí)間段內(nèi),各毛囊處于同一毛囊周期階段。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,小鼠毛囊細(xì)胞中有細(xì)胞角蛋白5(cytokeratin 5,Krt5)、細(xì)胞角蛋白 6(cytokeratin 6,Krt6)、細(xì)胞角蛋白 10(cytokeratin 10,Krt10)、細(xì)胞角蛋白 14(cytokeratin 14,Krt14)、細(xì)胞角蛋白 15(cytokeratin 15,Krt15)、細(xì)胞角蛋白 19(cytokeratin 19,Krt19)的表達(dá),但均缺乏整個(gè)周期中的系統(tǒng)研究。本文根據(jù)經(jīng)典的毛囊分期方案[4],選取了毛囊周期的幾個(gè)典型時(shí)期,包括毛囊發(fā)育期(出生后 1 d)、生長期啟動(dòng)(出生后 29 d)、生長期(出生后7 d)、退化期(出生后 18 d)和靜止期(出生后 56 d),檢測前述角蛋白在毛囊細(xì)胞中的表達(dá)情況,對(duì)其進(jìn)行分析,為闡明角蛋白在毛囊周期中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),為毛囊再生及毛囊周期調(diào)控研究提供借鑒。

    材料和方法

    一、主要材料

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57 BL/6小鼠購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

    2.倫理聲明:實(shí)驗(yàn)中所使用的動(dòng)物符合我國微生物的控制要求,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)過程及動(dòng)物處死方法,經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審核,符合動(dòng)物倫理和動(dòng)物福利要求。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(渝)20170002,使用許可證號(hào)為SYXK(渝)20170002。

    3.主要試劑及耗材:多聚甲醛,無水乙醇,二甲苯,石蠟,兔抗 KRT5、KRT6、KRT10、KRT14、KRT15、KRT19抗體(中國生工生物工程有限公司),封閉用羊血清,AF488標(biāo)記羊抗兔二抗(美國賽默飛世爾科技有限公司,),枸櫞酸鹽緩沖液,PBS,DAPI(中國碧云天生物技術(shù)公司),抗熒光猝滅封片劑,防脫組織切片。

    二、主要方法

    1.動(dòng)物標(biāo)本獲?。喝?P1、P7、P18、P29、P56(出生后 1、7、18、29、56 d)的 C57BL/6 小鼠,腹腔注射1%戊巴比妥100 μl;約5 min后,小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài),用剃毛器剃掉長出皮膚部分毛干,并用眼科剪剪掉未剃干凈毛干;用眼科剪剪取1 cm2的方形全層皮膚;將皮膚標(biāo)本在PBS中簡單清洗后,在濾紙上攤開,修剪平整;標(biāo)記好小鼠頭尾后,置于新鮮配制的4%多聚甲醛中,一起置于4 ℃冰箱。

    2.動(dòng)物標(biāo)本處理:取材組織塊,經(jīng)4%多聚甲醛過夜固定后,按以下順序進(jìn)行梯度脫水:50%乙醇2h→75%乙醇2 h→85%乙醇2h→95%的乙醇2h→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ15 min→二甲苯Ⅱ15 min;將組織塊置于預(yù)先融化的石蠟中浸泡4 h,石蠟包埋組織塊,注意包埋方向垂直瓶底,在石蠟切片機(jī)上進(jìn)行切片,切片厚度為 5 μm。

    3.免疫熒光:取前面獲取的切片,65 ℃烤片3 h;按一下順序進(jìn)行梯度水合:二甲苯Ⅰ15 min→二 甲 苯Ⅱ15 min→100%乙醇I 3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→95% 的 乙 醇3 min→85 %乙醇3 min→75 %乙醇3 min→50 %乙醇3 min→PBS 3 min;切片置于檸檬酸緩沖液,微波爐高火煮沸5 min,低火維持5 min;自然冷卻后取出,滴加稀釋后(1 : 50)的一抗,4 ℃過夜;PBS沖洗,3 min×4 次;避光條件下,滴加AF488標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h;PBS沖洗,3 min×3次;滴加1 : 10000 稀釋的 DAPI,室溫孵育 10 min;PBS 沖洗后,用抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察,拍照。

    結(jié) 果

    一、Krt5在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖1a),Krt5表達(dá)于毛囊漏斗部及毛母質(zhì)細(xì)胞。在生長期(圖1b),Krt5表達(dá)于外根鞘、內(nèi)根鞘及毛母質(zhì)細(xì)胞。在退化期(圖1c),Krt5表達(dá)于尚未凋亡的毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細(xì)胞。生長期啟動(dòng)(圖1d),Krt5表達(dá)于所有的毛囊上皮結(jié)構(gòu),包括次級(jí)毛芽、隆突區(qū)及外根鞘細(xì)胞。在靜止期(圖1e),Krt5表達(dá)于所有的毛囊上皮結(jié)構(gòu),包括隆突區(qū)和外根鞘。在所有毛囊周期中,Krt5均表達(dá)于表皮的角質(zhì)層及表皮細(xì)胞,而不表達(dá)于毛囊的毛乳頭細(xì)胞;其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    圖1 正置熒光顯微鏡下觀察Krt5在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    二、Krt6在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖2a),Krt6表達(dá)于毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細(xì)胞,在毛母質(zhì)細(xì)胞沒有表達(dá)。在生長期(圖2b),Krt6表達(dá)于外根鞘、內(nèi)根鞘及毛母質(zhì)細(xì)胞。在退化期(圖2c),Krt6表達(dá)于尚未凋亡的毛囊外根鞘及內(nèi)根鞘細(xì)胞。生長期啟動(dòng)及靜止期(圖2d、2e),Krt6僅在毛囊外根鞘細(xì)胞有表達(dá),在次級(jí)毛芽細(xì)胞沒有表達(dá)。在所有毛囊周期中,Krt6均表達(dá)于表皮的角質(zhì)層,在表皮細(xì)胞沒有表達(dá),在毛囊的毛乳頭細(xì)胞也沒有表達(dá);其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    圖2 正置熒光顯微鏡下觀察Krt6在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    三、Krt10在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖3a),Krt10表達(dá)于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘及內(nèi)根鞘前體細(xì)胞。在生長期(圖3b),Krt10表達(dá)于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘及內(nèi)根鞘前體細(xì)胞。在退化期(圖3c),Krt10表達(dá)于尚未凋亡的毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞。生長期啟動(dòng)(圖3d),Krt10表達(dá)于毛囊次級(jí)毛芽和隆突區(qū)細(xì)胞。在靜止期(圖3e),Krt10表達(dá)于毛囊隆突區(qū),但僅限于隆突區(qū)內(nèi)側(cè)靠近毛干部分。在所有毛囊周期中,Krt10均表達(dá)于表皮的角質(zhì)層及除基底層以外表皮細(xì)胞,在毛囊的毛乳頭細(xì)胞始終沒有表達(dá);其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    圖3 正置熒光顯微鏡下觀察Krt10在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    四、Krt14在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖4a),Krt14表達(dá)于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細(xì)胞。在生長期(圖4b),Krt14表達(dá)于毛囊毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細(xì)胞。在退化期(圖4c),Krt14表達(dá)于尚未凋亡的毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘及內(nèi)根鞘、毛干前體細(xì)胞。生長期啟動(dòng)(圖4d),Krt14表達(dá)于毛囊漏斗部、次級(jí)毛芽和隆突區(qū)下段。在靜止期(圖4e),Krt14表達(dá)于毛囊漏斗部和隆突區(qū),以及毛囊中部的部分外根鞘。在所有毛囊周期中,Krt14均表達(dá)于表皮細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞,在毛囊的毛乳頭細(xì)胞始終沒有表達(dá);其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    五、Krt15在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖5a),Krt15表達(dá)于毛囊隆突區(qū)細(xì)胞。在生長期(圖5b),Krt15表達(dá)于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細(xì)胞。在退化期(圖5c),Krt15表達(dá)于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細(xì)胞。生長期啟動(dòng)(圖5d),Krt15表達(dá)于毛囊次級(jí)毛芽和隆突區(qū)細(xì)胞。在靜止期(圖5e),Krt15表達(dá)于毛囊隆突區(qū)細(xì)胞。在所有毛囊周期中,Krt15均表達(dá)于表皮細(xì)胞,在毛囊的毛乳頭細(xì)胞始終沒有表達(dá);其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    圖4 正置熒光顯微鏡下觀察Krt14在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    圖5 正置熒光顯微鏡下觀察Krt15在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    六、Krt19在毛囊周期中的表達(dá)特征

    在毛囊發(fā)育期(圖6a),Krt19表達(dá)于毛囊隆突區(qū)。在生長期(圖6b),Krt19表達(dá)于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細(xì)胞。在退化期(圖6c),Krt19表達(dá)于毛囊隆突區(qū)及毛母質(zhì)以上部分的外根鞘細(xì)胞。生長期啟動(dòng)(圖6d),Krt19表達(dá)于毛囊次級(jí)毛芽和隆突區(qū)細(xì)胞。在靜止期(圖6e),Krt19表達(dá)于毛囊隆突區(qū)細(xì)胞。在所有毛囊周期中,Krt19均表達(dá)于基底層表皮細(xì)胞,在毛囊的毛乳頭細(xì)胞始終沒有表達(dá);其表達(dá)模式均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在細(xì)胞核內(nèi)沒有表達(dá)。

    圖6 正置熒光顯微鏡下觀察Krt19在毛囊周期中的表達(dá)(×400)

    討 論

    角蛋白是不溶性的纖維狀動(dòng)物蛋白質(zhì),是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白?;?xì)胞由生長層移向表層成為角質(zhì)化細(xì)胞的過程中,不斷分泌角蛋白,且含量逐漸增加[5]。在毛囊的結(jié)構(gòu)維持中,角蛋白發(fā)揮著重要作用[6],角蛋白甚至還參與腫瘤的發(fā)生[7]。因此,對(duì)角蛋白的研究一直是毛囊相關(guān)研究的重點(diǎn)[8]。在人的毛囊中,已有常見角蛋白的表達(dá)研究報(bào)道[9]。然而,在鳥類、嚙齒類動(dòng)物中,卻僅有散在報(bào)道[10]。因?yàn)槿说臉?biāo)本獲取困難,小鼠是最常見的研究模型。角蛋白在毛囊周期進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用[11],因此,對(duì)小鼠毛囊周期中角蛋白的表達(dá)情況研究顯得非常重要,可以為毛囊周期調(diào)控研究提供重要的數(shù)據(jù)支持。在毛囊研究中Krt5和Krt14常被作為毛囊結(jié)構(gòu)蛋白,顯示整個(gè)毛囊的上皮結(jié)構(gòu)[12-13]。本研究結(jié)果顯示,在生長期和退化期Krt5和Krt14幾乎表達(dá)于所有的毛囊上皮細(xì)胞,它們可以用于顯示毛囊結(jié)構(gòu);但是,在毛囊發(fā)育期和靜止期,Krt5和Krt14僅表達(dá)于部分毛囊上皮細(xì)胞,并不能用于顯示毛囊結(jié)構(gòu)。Krt6常被用作毛囊結(jié)構(gòu)蛋白,顯示毛囊內(nèi)根鞘[14-15];本研究結(jié)果提示,在毛囊周期的各個(gè)時(shí)期的內(nèi)根鞘中均有Krt6的表達(dá),因此,該蛋白適合顯示毛囊的內(nèi)根鞘細(xì)胞。和Krt6一樣,Krt10也常被用作毛囊結(jié)構(gòu)蛋白,顯示毛囊的內(nèi)根鞘;本研究結(jié)果提示,Krt10在毛囊發(fā)育期的毛球部均表達(dá),在生長期啟動(dòng)的次級(jí)毛芽也表達(dá),而毛球部和次級(jí)毛芽結(jié)構(gòu)中主要是一些前體細(xì)胞,而不是已經(jīng)分化的內(nèi)根鞘細(xì)胞,所以Krt10并不適合顯示這兩個(gè)時(shí)期的內(nèi)根鞘。Krt15和Krt19常被用作表皮干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記物[16-17],用于干細(xì)胞研究[18]。研究證明,毛囊干細(xì)胞棲息于毛囊皮脂腺下方的隆突區(qū)。本研究結(jié)果提示:在靜止期,Krt15和Krt19均僅在毛囊隆突區(qū)表達(dá),可以作為很好的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物;在生長期啟動(dòng),Krt15和Krt19除了在毛囊隆突區(qū)表達(dá)外,還在次級(jí)毛芽表達(dá),因此,表達(dá)這兩個(gè)角蛋白的細(xì)胞除了毛囊干細(xì)胞外,還有一些毛囊前體細(xì)胞和毛囊祖細(xì)胞;在生長期和退化期,Krt15和Krt19除了表達(dá)于隆突區(qū)外,還在毛囊下段的外根鞘表達(dá),因此,表達(dá)這兩個(gè)角蛋白的細(xì)胞除了毛囊干細(xì)胞外,還有一些已分化的毛囊外根鞘細(xì)胞,因此,Krt15和Krt19并不適合作為毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物,用于這兩個(gè)時(shí)期的毛囊干細(xì)胞。對(duì)于Krt15作為毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物的合理性,以前也有報(bào)道提出質(zhì)疑[19],與本研究結(jié)果一致。

    總之,本文系統(tǒng)研究了常見毛囊角蛋白在小鼠毛囊周期中的表達(dá)特征,與既往研究相比,發(fā)現(xiàn)了過去使用中的一些誤區(qū),供以后研究小鼠毛囊周期借鑒。包括:Krt5不適合作為毛囊發(fā)育期、生長期和退化期的毛囊上皮細(xì)胞標(biāo)記物、Krt14不適合作為毛囊發(fā)育期和靜止期的毛囊上皮細(xì)胞標(biāo)記物、Krt10不適合毛囊發(fā)育期和毛囊生長期啟動(dòng)的毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞標(biāo)記物、Krt15和Krt19不適合毛囊生長期和退化期的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物。所檢測的幾種角蛋白作為毛囊結(jié)構(gòu)或毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物僅適用于特定的毛囊周期。因此,研究者在使用毛囊角蛋白作為標(biāo)記物時(shí),應(yīng)首先明確其在毛囊周期中的表達(dá)情況。當(dāng)然,本研究的結(jié)論還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。可以考慮從以下兩方面進(jìn)行進(jìn)一步研究:一方面,本研究僅研究了這些角蛋白的蛋白表達(dá)情況,將來可以進(jìn)一步研究這些角蛋白的mRNA原位表達(dá)情況,并與蛋白水平進(jìn)行比較;另一方面,本研究僅使用了一家公司的抗體,對(duì)每個(gè)角蛋白也僅使用了一個(gè)抗體進(jìn)行研究,將來可以使用其他公司或針對(duì)其他表位的抗體進(jìn)行研究,抗體的不同也有可能得出不同的結(jié)果。

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