苗藥黑骨藤不同極性提取部位急性毒性及抗氧化研究

金文淵 楊欣 劉育辰 劉剛

摘要[目的]對(duì)黑骨藤不同極性部位進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)及抗氧化研究，確定其臨床用藥安全性及活性部位。[方法]急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用SD（180～220g）大鼠，連續(xù)灌胃給藥7d（9.75g/kg）后，測(cè)定血清中的肝功能和腎功能等相關(guān)指標(biāo)，觀察其肝臟、腎臟毒性反應(yīng)，采用ABTS（agreementofbasictelecommunicationsservices）法測(cè)定肝臟中的總抗氧化能力。[結(jié)果]黑骨藤不同極性部位給藥7d后，大鼠未出現(xiàn)死亡，石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位組對(duì)肝臟和腎臟生化指標(biāo)均無顯著性影響（P>0.05），水部位組大鼠血清中的ALP和BUN顯著升高（P<0.05）。[結(jié)論]黑骨藤的不同極性部位中的石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，水部位中的ALP和BUN升高，可能表現(xiàn)出微低毒性。氯仿部位和正丁醇部位表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞黑骨藤;急性毒性;肝損傷;腎損傷;抗氧化能力

中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

機(jī)體要通過一些抗氧化劑防御系統(tǒng)使自由基的產(chǎn)生與消除維持在一個(gè)生理性低水平。一旦自由基過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，自由基的產(chǎn)生與消除就會(huì)失去平衡，而過多自由基誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)將會(huì)引起膜損傷，從而導(dǎo)致核酸代謝產(chǎn)生誤差，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、心腦血管疾病、炎癥、糖尿病等多種疾病。因此通過體外攝入一些抗氧化劑或自由基清除劑來維持機(jī)體內(nèi)自由基代謝的平衡對(duì)于預(yù)防疾病的發(fā)生和人體的健康具有十分重要的意義。目前，中藥中的抗氧化性成分很多，如黃酮類、多酚類、多糖類等，這些都屬于植物類抗氧化性成分。這些抗氧化劑具有較強(qiáng)的還原性，在人體內(nèi)可以清除人體內(nèi)不利的自由基，這些抗氧劑可以保護(hù)機(jī)體免受于這些自由基的損害。近年來，醫(yī)藥行業(yè)、保健食品行業(yè)，越來越關(guān)注從中藥中提取分離和純化抗氧化活性成分，這些應(yīng)用研究為開發(fā)植物來源抗氧劑奠定了良好的基礎(chǔ)[1-3]。

黑骨藤藥材資源豐富，具有悠久的臨床應(yīng)用和食用歷史，生物活性十分廣泛，為貴州常用治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾病及頸肩臂腰腿疼痛的苗藥。目前已開展大量的化學(xué)成分和藥理作用研究，并取得了諸多成果。黑骨藤的主要功效活血通經(jīng)、祛風(fēng)濕，治跌打損傷、風(fēng)濕痹疼、口腔炎、咽喉炎、乳腺炎等。但是黑骨藤超量或誤服大量則引起中毒，輕則惡心、嘔吐、暈厥，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)心律失常，甚則危及生命。黑骨藤不同極性部位目前缺少其毒性及抗氧化活性的相關(guān)資料[4-6]。急性毒性試驗(yàn)（acutetoxicitytest）是新藥研發(fā)和藥物毒理不可以缺少的藥理試驗(yàn)，對(duì)闡明藥物的毒性作用、了解其毒性靶器官具有指導(dǎo)作用。筆者通過SD大鼠經(jīng)口接受單劑量的黑骨藤不同極性部位混懸液，觀察大鼠在短期內(nèi)出現(xiàn)的異常反應(yīng)以及各主要臟器有無異常改變，探討其在生物體內(nèi)應(yīng)用的安全性，為進(jìn)一步研究、開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物。SD大鼠，雌性，體重180～220g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK-（湘）2014-0011。

1.1.2

試劑及藥物配制。藥材采自貴州省貴陽市開陽縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院魏升華教授鑒定為蘿藦科杠柳屬黑骨藤（PerplocaforrestiiSchltr.），藥材樣品保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）、總蛋白（TP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）試劑盒均購(gòu)自北京豪邁生物工程有限公司;總抗氧化能力試劑盒（A015-2），南京建成生物科技有限公司，批號(hào)20170705。

1.1.3儀器。yc-ro/40純水器（四川怡創(chuàng)科技有限公司）;Varioskanflash酶標(biāo)儀（ThermofisherScientific）;Allegrax-30rcentrifuge4℃離心機(jī)（Beckmancoulter）;Forma8800超低溫冰箱（ThermofisherScientific）;Puzs-300全自動(dòng)生化儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）;MettlerToledo電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1供試品制備。黑骨藤藥材陰干，切段，粉碎成粗粉，用8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，趁熱過濾，合并濾液減壓濃縮至稠膏狀，得醇提物，用適量蒸餾水進(jìn)行分散，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

1.2.2分組及給藥。雌性SD大鼠42只（180～220g），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組，每組各7只。灌胃給藥前禁食12h，不禁水。各組給藥劑量按人臨床用量的65倍計(jì)算，各組給藥劑量即為9.75g/kg，用0.5%CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）配制成濃度為0.4875g/mL的黑骨藤各部位混懸液，空白對(duì)照組灌胃等量0.5%CMC-Na。所有大鼠在灌胃給藥后進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，連續(xù)給藥7d。各組飼養(yǎng)過程中保持室溫度、濕度等均衡，自由進(jìn)食飲水[7-8]。

1.2.3試驗(yàn)取材。試驗(yàn)取材前大鼠禁食12h，不禁水，次日上午SD大鼠通過腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉（5mL/kg體重），迅速打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。取出心、肝、脾、肺、腎、腦分別用錫箔紙包好，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)試驗(yàn)指標(biāo)選用同一部位的組織進(jìn)行。

1.2.4大鼠血清生化指標(biāo)。SD大鼠腹主動(dòng)脈取血之后靜置30min，3500r/min離心15min，取1mL上清液置2mL離心管中。采用Puzs-300全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清生化指標(biāo)，具體指標(biāo)包括AST、ALP、ALT、BUN、TP、CRE、ALB、GLU、TG、CHO、LDH[9]。

1.2.5總抗氧化能力檢測(cè)。準(zhǔn)確稱取肝臟組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶4的比例，加入4倍體積的生理鹽水或者磷酸緩沖鹽溶液（PBS），冰水浴條件下機(jī)械勻漿，以充分破碎細(xì)胞并釋放其中的抗氧化物，4℃，12000r/min，離心5min，取上清測(cè)定。取10mmol/LTrolox標(biāo)準(zhǔn)液用雙蒸水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在405nm采用酶標(biāo)儀讀取各孔OD（光密度）值[8-9]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以±SD表示，采用單因素方差分析，結(jié)果以P<0.05為顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1黑骨藤不同極性提取部位對(duì)大鼠體溫和體重的影響

從表1～2可看出，給藥7d后，黑骨藤有效部位體溫和體重都有增高，與給藥前進(jìn)行比較，第4天和第6天體重和體溫呈增高趨勢(shì)，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1肝臟功能。試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，與空白對(duì)照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組的ALT、AST、ALP無顯著性差異（P>0.05），水部位組中的ALP升高，差異顯著（P<0.05）。蛋白合成主要在肝臟中完成，肝臟不僅能合成自身蛋白，還能分泌90%以上的血漿蛋白質(zhì)。通過試驗(yàn)結(jié)果分析，黑骨藤不同極性部位中石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組與空白組比較，大鼠ALB、TP均屬于正常范圍，沒有發(fā)生顯著變化。

2.2.2腎功能。腎臟最主要的功能是維持體液平衡及體內(nèi)酸堿平衡。腎臟通過腎小球的濾過、腎小管的重吸收及分泌功能，排出體內(nèi)多余的水分，調(diào)節(jié)酸堿平衡，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，與空白對(duì)照組比較，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組血清中的BUN、CRE無顯著性差異（P>0.05），水部位組血清中的BUN升高，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2.3脂類代謝。血液中的膽固醇大多數(shù)都能與脂肪酸結(jié)合，僅有少數(shù)的以游離狀態(tài)存在的膽固醇作為細(xì)胞膜的成分維持細(xì)胞的形態(tài)和功能，膽固醇測(cè)定對(duì)脂肪代謝異常有很大的幫助。試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，與空白對(duì)照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組的TG無顯著性差異（P>0.05）。

2.2.4糖代謝。由表3可知，與空白對(duì)照組相比，氯仿部位組、醋酸乙酯部位組和水部位組的GLU無顯著性差異（P>0.05）;石油醚部位組、正丁醇部位組的GLU明顯降低，具有顯著差異（P<0.01）。

2.2.5能量代謝。乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）分布廣泛，機(jī)體組織中幾乎都存在，在糖代謝過程發(fā)揮重要作用。試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，與空白對(duì)照組相比，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組和水部位組的LDH有降低趨勢(shì)，但是無顯著性差異（P>0.05）;正丁醇部位組能顯著降低LDH（P<0.05）。

2.3總抗氧化能力

以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)、各OD值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用SPSS得出曲線公式，把樣本測(cè)定管測(cè)得的OD代入計(jì)算公式，求得結(jié)果[10]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.932X+1.2216。與空白對(duì)照組比較，石油醚部位組、氯仿部位組、醋酸乙酯部位組、正丁醇部位組和水部位組的TOC明顯升高，具有顯著性差異（P<0.05）。詳見表3。

3結(jié)論與討論

動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育情況、營(yíng)養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)及健康情況主要由動(dòng)物外觀、體溫、體重等一般指標(biāo)可反映，若生長(zhǎng)過程中受到毒物、外界環(huán)境等因素的影響，可以通過生長(zhǎng)發(fā)育和外觀反映。該研究采用SD大鼠連續(xù)灌胃給藥7d，用藥劑量相當(dāng)于人臨床用藥65倍，發(fā)現(xiàn)黑骨藤有效部位體溫和體重呈增高趨勢(shì)，第6天體重和體溫明顯增高，可能由于黑骨藤是溫性中藥，所以體溫和體重增高。血液生化能準(zhǔn)確地反映機(jī)體的損傷程度，是臨床和試驗(yàn)研究比較常用的方法，黑骨藤有效部位在TG、AST、ALT、ALP、GLU、BUN等生化指標(biāo)中存在一定的差異性。AST、ALT、ALP主要存在肝臟中，作為判斷肝臟損傷的經(jīng)典指標(biāo)[10-12]。TG主要在肝臟發(fā)生代謝反應(yīng)，可以氧化供能，也可以分泌進(jìn)入血液，被其他組織利用，當(dāng)肝臟損傷時(shí)，血中TG水平升高。黑骨藤的有效部位水相造成血清ALP升高，使膽汁排泄受到抑制，但血清中的TG未表現(xiàn)出增高趨勢(shì)，可能由輕微毒性。綜上所述，黑骨藤水相部分有一定的毒性，但是比較小。服用劑量要適量，不能長(zhǎng)時(shí)間服用。葡萄糖（GLU）在機(jī)體中以碳水化合物的形式被機(jī)體直接吸收利用，發(fā)生氧化反應(yīng)，為機(jī)體供應(yīng)活動(dòng)所需要的能量。黑骨藤有效部位中的石油醚和正丁醇使血清中的GLU顯著降低，可能使糖耐量受損或糖代謝異常導(dǎo)致，不宜長(zhǎng)期大劑量服用。

目前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎給人類健康造成了嚴(yán)重威脅，人們逐漸開始重視。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)炎癥和滑膜組織增生為特征的慢性自身免疫性疾病，可引起大量細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生，最終導(dǎo)致軟骨和骨的破壞，研究表明，黑骨藤具有很好的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用[13]。機(jī)體作為一個(gè)整體，存在多種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，主要功能是清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，防止產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)的氧化壓力?？偪寡趸芰χ饕煽寡趸蠓肿?、抗氧化小分子和酶的總的水平體現(xiàn)。抗氧化功能評(píng)價(jià)方法主要在體內(nèi)和體外進(jìn)行評(píng)價(jià)。體內(nèi)抗氧化方法主要采用動(dòng)物模型，研究證明，人體的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有相似性，是比較完善和復(fù)雜功能的系統(tǒng)，機(jī)體抗氧化的能力越強(qiáng)，能有效抵抗外界侵害越強(qiáng)[14-15]。黑骨藤有效部位石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、水部位都具有一定的抗氧化能力，有待于進(jìn)一步進(jìn)行活性研究，希望能為臨床提供一個(gè)抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新藥。

參考文獻(xiàn)

[1]楊玲，許速.氧化應(yīng)激與疾病發(fā)生的相關(guān)性[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2012，22（11）：1268-1270.

[2]SACHIDANANDAMK，F(xiàn)AGANSC，ERGULA.Oxidativestressandcardiovasculardisease：Antioxidantsandunresolvedissues[J].CardiovascDrugRev，2005，23（2）：115-132.

[3]李洋，馬文平，倪志婧.寧夏枸杞體外抗氧化機(jī)理研究[J].食品科學(xué)，2014，35（1）：79-84.

[4]劉明，劉剛，劉育辰，等.黑骨藤鎮(zhèn)痛抗炎作用活性部位篩選[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37（4）：322-325.

[5]張令令，肖智勇，馬淵，等.苗藥黑骨藤多糖部位HGT-5A的細(xì)胞免疫抑制作用及其可能的活性成分[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2011，25（6）：538-542.

[6]陳芳，汪毅.苗藥黑骨藤的研究及開發(fā)應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，19（1）：6-7.

[7]王秋紅，楊欣，王蒙，等.黃芩與黃柏協(xié)同保護(hù)黃藥子致肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41（5）：898-903.

[8]曹亮亮，王文曉，張麗，等.基于“有故無殞”思想的醋甘遂毒性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（16）：3249-3255.

[9]侯甲福，鄭著家，劉世娟，等.錦花清熱膠囊對(duì)動(dòng)物急性及長(zhǎng)期毒性研究[J].毒理學(xué)雜志，2016，30（2）：172-173.

[10]趙子婧，鞏政，史少澤，等.補(bǔ)骨脂及其與甘草配伍單次給藥大鼠的毒代動(dòng)力學(xué)及肝腎毒性初探[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（11）：2221-2226.

[11]程生輝，張妍妍，李會(huì)芳，等.基于黃疸模型大鼠的梔子苷急性肝腎毒性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（4）：174-178.

[12]郭曉，王萌，朱彥，等.中藥腎毒性機(jī)制研究現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（23）：3581-3591.

[13]CHENL，LIJS，KEX，etal.ThetherapeuticeffectsofPeriplocaforrestiiSchltr.StemextractsoncollageninducedarthritisbyinhibitingtheactivationofSrc/NFκBsignalingpathwayinrats[J].JEthnopharmacology，2017，202：12-19.

[14]李維熙，李怡芳，何蓉蓉.兒茶素類化合物抗氧化評(píng)價(jià)方法及作用機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（2）：295-303.

[15]陳凡，馬善麗，許穎，等.超高壓處理對(duì)豆乳總多酚、類黃酮含量及其抗氧化性的影響[J].大豆科學(xué)，2011，30（2）：310-313.