β-環(huán)糊精修飾Mn-ZnS量子點熒光探針用于檢測血液中對乙酰氨基酚

曾燕艷, 王玥婷, 梁志輝, 焦 哲, 范洪波

(東莞理工學(xué)院 生態(tài)環(huán)境與建筑工程學(xué)院，廣東 東莞 523808)

1 引 言

對乙酰氨基酚(Acetaminophen，ACOP)是一種具有解熱鎮(zhèn)痛功效的酰胺類藥物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。但是，對乙酰氨基酚對人體有一定的毒副作用，過多服用可致肝腎衰竭[1-2]。因此，對對乙酰氨基酚含量的檢測方法研究，對生理功能和臨床應(yīng)用都具有重要的意義。現(xiàn)行的藥品標(biāo)準中對對乙酰氨基酚的測定方法是重氮化的外指示劑法，該方法步驟繁瑣、終點不易掌握。據(jù)報道，不少學(xué)者開發(fā)了新型的對乙酰氨基酚的測定方法，郭波等[3]采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法對小鼠血漿中對乙酰氨基酚進行定量分析，檢測范圍為0.2～10.0 μg/mL。王書民等[4]利用對乙酰氨基酚在堿性介質(zhì)下對CdS量子點-高錳酸鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系強烈的抑制作用，建立了對藥物中對乙酰氨基酚的流動注射化學(xué)發(fā)光測定法，其借助發(fā)光信號對對乙酰氨基酚的含量進行定量分析。劉益慶等[5]建立了測定小兒氨酚烷胺顆粒中對乙酰氨基酚含量的高效液相蒸發(fā)發(fā)光法(HPLC-ELSD)，該方法在濃度為2.017～10.084 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。Beitollahi等[6]利用石墨烯和乙基-(4-二茂基-[1,2,3]咪唑)醋酸鹽修飾碳糊電極，利用該電極建立了快速測定對乙酰氨基的電化學(xué)法，其測定濃度為75.0～900.0 μmol/L。Kim等[7]采用兩步活化法(ZnCl2-KOH)對以海藻為原料的活性炭進行修飾，制備出一種新型的電極材料，用于測定人體中對乙酰氨基酚的含量，其檢出限為0.004 μmol/L。Menon等[8]提出了一種簡單可靠的基于分子印跡聚合物的伏安法測定藥物中的對乙酰氨基酚。以對乙酰氨基酚為模板分子制備出分子印跡聚合物，通過電聚合的方式將MIP修飾到AuNPs改性的金電極表面，增大傳感器的電信號，從而提高其選擇性和靈敏度。研究結(jié)果表明，該方法的電信號值在對乙酰氨基酚的濃度為4.5×10-5～5.0×10-7mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。Arif等[9]將β-環(huán)糊精修飾到多壁碳納米管上，增強納米管的比表面積和親水性，再將其涂抹到玻璃碳電極上，制備出MWCNT-βCD/GCE，用于測定水體中對乙酰氨基酚的含量，其線性響應(yīng)范圍為50 nmol/L～300 μmol/L。Cao等[10]用兩步合成法制備出CeBiOx納米纖維電極，采用循環(huán)伏安法和差士脈沖伏安法，對止痛劑中的對乙酰氨基酚含量進行測定，其檢出限為0.2 μmol/L。綜上所述，目前對乙酰氨基酚的常用檢測方法主要有高效液相色譜法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]和電化學(xué)法[13-14]等，這些方法雖然簡便快速、靈敏度高，但其檢測主要針對藥物中對乙酰氨基酚的含量，且檢測范圍主要是微克級別，對于更低含量的對乙酰氨基酚存在局限性。本研究基于對乙酰氨基酚對量子點的熒光猝滅機理，建立一種簡便快捷、靈敏度高、對對乙酰氨基酚進行痕量分析的新方法。

量子點由于其獨特的光學(xué)性質(zhì)和較好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、電子和生物傳感領(lǐng)域，如用于離子檢測[15]、分子識別[16]和免疫分析[17]等。本研究合成了具有良好熒光特性和水溶性的乙二胺-環(huán)糊精修飾的Mn-ZnS量子點(EN-β-CD-QDs)，并利用合成的EN-β-CD-QDs建立一種簡單有效的對乙酰氨基酚(ACOP)檢測方法。EN-β-CD-QDs的合成以L-半胱氨酸(L-Cys)為橋梁，將乙二胺-環(huán)糊精修飾到量子點表面。以EN-β-CD-QDs作為熒光探針，利用其表面修飾的β-環(huán)糊精對ACOP進行包合，ACOP與EN-β-CD-QDs的表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移過程進而使EN-β-CD-QDs的熒光猝滅，基于這一原理建立ACOP的熒光檢測方法。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

實驗試劑包括：β-環(huán)糊精(β-CD)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、對甲苯磺酰氯(TsCl)(99%，上海麥克林生化科技有限公司)、L-半胱氨酸(L-Cys)(99%，上海麥克林生化科技有限公司)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(98.5%，上海麥克林生化科技有限公司)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(98%，上海麥克林生化科技有限公司)、對乙酰氨基酚(ACOP)(98.5%，北京百靈威科技有限公司)、醋酸錳(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、醋酸鋅(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、硫化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、乙二胺(天津市富宇精細化工有限公司)、NaOH(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、丙酮(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。實驗所用的試劑除特別注明外均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

樣品的晶體結(jié)構(gòu)利用Ultima-IV型X射線衍射儀(XRD)(布魯克(北京)科技有限公司)進行分析驗證。粒子的形貌利用Tecnai F30型透射電子顯微鏡(TEM)(美國FEI公司)和JSM-6701F型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會社)觀察。樣品的熒光光譜利用UVD170U型紫外-可見分光光度計(Dionex Softron GmbH)和F-4500型熒光分光光度計(日立儀器(上海)有限公司)測得。

2.2 EN-β-CD-QDs的合成

2.2.1 L-Cys-Mn摻雜ZnS量子點的合成

在三口燒瓶中依次加入0.096 96 g L-Cys、50 mL H2O、1.5 mL 0.02 mol/L醋酸錳和5 mL 0.2 mol/L醋酸鋅，攪拌溶解后，用2.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=11。在氮氣保護下逐滴加入5 mL 0.3 mol/L硫化鈉溶液，并攪拌30 min。得到的混合溶液于50 ℃下陳化2 h，冷卻至室溫。然后用無水乙醇析出沉淀，離心后取沉淀，用無水乙醇洗滌3次以去除雜質(zhì)。最后于50 ℃條件下真空干燥12 h。

2.2.2 EN-β-CD的合成

稱取30.0 gβ-CD 和7.8 g TsCl置于720 mL去離子水中，攪拌2～3 h。然后加入120 mL 2.5 mol/L的NaOH，繼續(xù)攪拌30 min，過濾，收集濾液，并將濾液倒入36.0 g NH4Cl中，放入冰箱靜置12 h后，過濾得到白色固體，重結(jié)晶操作3次后得到亮白色晶體。最后置于50 ℃真空條件下干燥12 h，得到白色粉末，記為Mono-6-OTs-β-CD。

取3.0 g Mono-6-OTs-β-CD溶于20 mL無水乙二胺中，在氮氣氛圍下，升溫至80 ℃，持續(xù)攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后采用減壓蒸發(fā)去除溶劑，將殘余反應(yīng)液逐滴加入丙酮中，得到白色沉淀，收集沉淀溶于少量水中，再將水溶液逐滴加入丙酮，反復(fù)多次得到較純的白色沉淀，收集沉淀于40 ℃真空下干燥7 h，得到最終產(chǎn)物EN-β-CD。

2.2.3 EN-β-CD修飾ZnS量子點

稱取20 mg L-Cys-Mn摻雜ZnS量子點溶于20 mL PBS緩沖液中，加入10 mg EDC和10 mg NHS，攪拌30 min以活化。然后加入100 mg EN-β-CD，繼續(xù)攪拌5 h。用適量無水乙醇洗出環(huán)糊精量子點，離心分離，去掉清液，反復(fù)用少量無水乙醇洗滌沉淀，得到較純產(chǎn)物，最后于50 ℃真空下干燥12 h。

2.3 熒光檢測

分別配制0.01 mg/mL的EN-β-CD-QDs溶液和0.01 mg/mL的對乙酰氨基酚溶液。取100 μL對乙酰氨基酚溶液，加入到10 mL EN-β-CD-QDs溶液中，超聲震蕩30 min，于25～45 ℃水浴條件下反應(yīng)5～45 min，在激發(fā)波長為300 nm，發(fā)射波長為310～740 nm，入射狹縫為5 nm、出射狹縫為5 nm的條件下進行熒光測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 EN-β-CD-QDs的結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)是EN-β-CD和β-CD的紅外光譜圖。由圖可知，3 381，2 927，1 080 cm-1附近的峰證明了—OH、—NH、—CH和—CN的存在，而EN-β-CD中815 cm-1的苯環(huán)基團的吸收峰已消失，說明對甲苯磺酰基已經(jīng)被乙二胺所取代，得到的產(chǎn)物為EN-β-CD[18]。此外，946,1 028,1 158 cm-1附近出現(xiàn)β-CD的特征吸收峰，分別代表 α-(1, 4)糖苷鍵的骨架振動、C—C/C—O 鍵耦合振動峰和C—O—C 鍵伸縮振動峰，表明EN-β-CD保留了β-CD 分子的空腔結(jié)構(gòu)[19]。

圖1(b)是 EN-β-CD-QDs 和 L-Cys-QDs 的紅外光譜圖。通過對比修飾前后的量子點紅外光譜圖可知，1 029,1 154 cm-1處分別出現(xiàn)C—C/C—O 鍵耦合振動峰和C—O—C 鍵伸縮振動峰，為β-CD 結(jié)構(gòu)的特征峰，1 080 cm-1左右的是C—N振動吸收峰，2 930 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動。其位置峰值大概重復(fù)于β-CD，說明環(huán)糊精已經(jīng)成功修飾到了量子點上。

由圖1(c)EN-β-CD-QDs的透射電鏡(TEM)表征結(jié)果可知，EN-β-CD-QDs 呈現(xiàn)單分散排列，形狀為球形，粒徑分布均勻。EN-β-CD-QDs 的X射線衍射(XRD)表征結(jié)果如圖1(d)所示。由圖可知，2θ=28.76°,47.35°,57.20°處的3個衍射峰與ZnS立方閃鋅礦晶型的(111)、(220)、(311)晶面相對應(yīng)，而且沒有看到其他的衍射峰，說明合成的產(chǎn)物有閃鋅礦結(jié)構(gòu)的ZnS晶型且純度較高，修飾上去的環(huán)糊精并不影響ZnS量子點的晶型。

由圖1(e)紫外吸收光譜可知，對乙酰氨基酚(APAP)在250 nm附近有較強的紫外吸收，EN-β-CD-QDs 在300 nm處有紫外吸收。但是，EN-β-CD-QDs 在300 nm的激發(fā)波長下的熒光光譜(圖1(f))與對乙酰氨基酚的紫外吸收光譜沒有重疊部分，故兩者的發(fā)光機理不存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。

圖1 EN-β-CD-QDs的表征。(a)EN-β-CD和β-CD的紅外光譜；(b)EN-β-CD-QDs 和 L-Cys-QDs 的紅外光譜；(c)EN-β-CD-QDs的透射電鏡圖；(d)EN-β-CD-QDs 的X射線衍射譜；(e)紫外吸收光譜；(f)L-Cys-QDs和EN-β-CD-QDs的熒光發(fā)射光譜，λ=300 nm。

Fig.1 Characterization of EN-β-CD-QDs. (a)FT-IR of EN-β-CD andβ-CD.(b) FT-IR of EN-β-CD-QDs and L-Cys-QDs. (c) TEM image of EN-β-CD-QDs. (d) XRD of EN-β-CD-QDs. (e) UV absorption spectra of EN-β-CD-QDs, APAP and their mixture. (f) Fluorescence spectra of L-Cys-QDs(left) and EN-β-CD-QDs(right), excited atλ=300 nm.

圖1(f)分別是L-Cys-QDs和EN-β-CD-QDs在激發(fā)波長為300 nm下的熒光發(fā)射光譜。由圖可知，未經(jīng)過環(huán)糊精修飾的L-cys-ZnS量子點加入對乙酰氨基酚前后熒光強度沒有明顯的變化，而經(jīng)過β-CD修飾后的EN-β-CD-QDs與對乙酰氨基酚反應(yīng)，有明顯的熒光強度降低，這說明EN-β-CD-QDs對于對乙酰氨基酚具有更強的識別作用。

3.2 檢測條件優(yōu)化

3.2.1 水浴反應(yīng)時間

取100 μL 0.01 mg/mL的對乙酰氨基酚溶液分別加入到10 mL 0.01 mg/mL的EN-β-CD-QDs溶液中，分別水浴反應(yīng)5,15,25,35,45 min，取適量的反應(yīng)混合溶液檢測其熒光強度，結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)時間的延長，EN-β-CD-QDs與對乙酰氨基酚相互作用的熒光強度逐漸下降，當(dāng)反應(yīng)時間大于35 min時，熒光強度趨于穩(wěn)定，說明兩者反應(yīng)基本完全，故實驗以35 min作為最佳水浴反應(yīng)時間。

圖2 水浴反應(yīng)時間對熒光強度的影響

Fig.2 Influence of reaction time on the fluorescence intensity

3.2.2 水浴反應(yīng)溫度

水浴反應(yīng)時間為35 min，改變水浴反應(yīng)溫度為25,30,35,40,45,50 ℃，考察反應(yīng)溫度對熒光強度的影響。當(dāng)加入目標(biāo)物對乙酰氨基酚后(圖3)，溫度為40 ℃時，溶液的熒光強度降到最低，基于對乙酰氨基酚與EN-β-CD-QDs發(fā)生電子轉(zhuǎn)移、引起熒光猝滅現(xiàn)象、進而降低熒光強度的機理，本實驗選擇40 ℃作為最佳水浴反應(yīng)溫度。

圖3 反應(yīng)溫度對熒光強度的影響

Fig.3 Influence of reaction temperature on the fluorescence intensity

3.3 對乙酰氨基酚的檢測

以300 nm作為EN-β-CD-QDs的激發(fā)波長，在310～740 nm 的發(fā)射波長條件下考察EN-β-CD-QDs的熒光強度隨對乙酰氨基酚濃度的變化(圖4)。對乙酰氨基酚在一定濃度范圍能夠線性猝滅EN-β-CD-QDs的熒光，據(jù)此建立EN-β-CD-QDs檢測對乙酰氨基酚的方法。在最佳條件下，EN-β-CD-QDs對對乙酰氨基酚的檢測結(jié)果表明，在濃度為1～100 ng/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，檢出限為0.64 ng/L，RSD為1.69%(n=11)。

圖4 對乙酰氨基酚對EN-β-CD-QDs熒光強度的影響(a～i: 0,1,15,30,45,60,75,90,100 ng/L)

Fig.4 Fluorescence spectra of EN-β-CD-QDs to various acetaminophen concentrations (a-i: 0, 1, 15, 30, 45, 60, 75, 90,100 ng/L). Inset: resulting calibration curve.

3.4 熒光猝滅機理分析

量子點檢測目標(biāo)物的發(fā)光原理主要可以分為熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(FRET)和電子轉(zhuǎn)移原理(ET)兩類。經(jīng)過實驗證明，對乙酰氨基酚對EN-β-CD-QDs的熒光猝滅并不是由FRET引起的。由圖1(e)和1(f)可以明顯看出對乙酰氨基酚紫外吸收光譜與EN-β-CD-QDs熒光發(fā)射光譜之間不存在任何重疊區(qū)域，說明二者不具備發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的條件。有研究表明[20]，β-CD同時具有親水的外表面和強烈的疏水內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，既可以很好地保持EN-β-CD-QDs的水溶性，又可以對客體分子進行包合。對乙酰氨基酚是一種良好的電子受體，其作為疏水客體可以被β-CD包合，進入空腔后與量子點發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，致使量子點的熒光發(fā)生猝滅。

對乙酰氨基酚對EN-β-CD-CDs的熒光猝滅機理詳見圖5。

圖5 β-環(huán)糊精修飾量子點對ACOP的檢測機理

3.5 血液樣品的檢測

取50 mL人體血液樣品，溶于水中，超聲30 min，離心過濾，取濾液定容至50 mL。測定時逐級稀釋，按照實驗方法，對血樣中的對乙酰氨基酚進行檢測，測得血樣中對乙酰氨基酚的含量為0.664 8 μg。為檢驗方法的可靠性，同時進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品檢測與回收率測定(n=5)

4 結(jié) 論

采用β-CD與乙二胺在堿性條件下反應(yīng)，合成了水溶性好的乙二胺-β-環(huán)糊精(EN-β-CD)，再將EN-β-CD修飾到L-Cys摻雜的Mn-ZnS量子點表面，制備出具有良好的熒光特性和水溶性并能很好地溶解在水溶液中的乙二胺-環(huán)糊精-ZnS量子點材料(EN-β-CD-QDs)。利用EN-β-CD-QDs作為熒光探針對水體中對乙酰氨基酚進行檢測，成功建立了對乙酰氨基酚的熒光檢測分析方法。在實驗過程中，考察了反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度等因素對對乙酰氨基酚檢測的影響。結(jié)果表明，在反應(yīng)時間為35 min、反應(yīng)溫度為40 ℃的條件下，對乙酰氨基酚在1～100 ng/L的濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限達到0.64 ng/L。