環(huán)氧合酶-2 對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的人鱗狀細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

申建剛 王紅芳 陳麗 李俊達(dá) 李勇年

深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科（廣東深圳518109）

Barrett 食管（Barrett′s esophagus，BE）是指正常的復(fù)層鱗狀上皮被單層柱狀上皮所取代的一種病理現(xiàn)象，其發(fā)生主要與胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）、遺傳、肥胖、生活方式、性別、種族等相關(guān)，其中GERD 最重要［1］。BE 伴腸上皮化生者屬于食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）的癌前病變［2］。阻止BE 發(fā)生、發(fā)展是避免EAC 的一個(gè)重要途徑。目前BE 發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，在人BE 組織中環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達(dá)較周?chē)[狀上皮組織顯著增高，所以推測(cè)COX-2 在BE 發(fā)病中起重要作用。

本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)沉默COX-2 表達(dá)，探討COX-2 對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的人鱗狀細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 COX-2、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子-2（caudal-related homeoboxgene-2，CDX-2）、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（phosphorylation of nuclear factor-κB，NF-κB/p-P65）及GAPDH 鼠抗人單克隆抗體、熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Epitomics 公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RNA 提取Trizol試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、RPMI1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。將膽鹽成分［5］（sigma 公司）?；悄懰帷⒏拾蹦懰?、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫、氧膽酸、甘氨脫氧膽酸和?；敲撗跄懰岚?0∶15∶3∶6∶1 的比例混合加入培養(yǎng)基。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗狀細(xì)胞株HET-1A 購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)（ATCC，Manassas，VA，USA）。細(xì)胞用含有10%胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 siRNA 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 抗人COX-2 siRNA 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，COX-2 siRNA 序列正義：5′-AACUGCUCAACACCGGAAUtt-3′；反義：5′-AUUCCGGUGUUGAGGAGUUtt-3′。陰性對(duì)照siRNA 序列正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3′；反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3′。待Het-1A 細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)瓶底90%時(shí)消化，離心，重懸后轉(zhuǎn)入24孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到約60%～70%的融合面積時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白對(duì)照組（只接種HET-1A 細(xì)胞未作任何處理）、陰性對(duì)照組（用陰性siRNA 轉(zhuǎn)染HET-1A 細(xì)胞）、COX-2 組（用COX-2 轉(zhuǎn)染HET-1A 細(xì)胞）及COX-2 siRNA 組（用COX-2 siRNA 轉(zhuǎn)染HET-1A 細(xì)胞）。通過(guò)Western blot檢測(cè)COX-2表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染效果。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，加入100 μL buffer，混勻，用10 μL FIYC 和5 μL PI 進(jìn)行染色，4 ℃避光作用30 min 后，再加入300 μL buffer，混勻，將細(xì)胞置激發(fā)光為488 nm 波長(zhǎng)的FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用ModFit LT 軟件分析結(jié)果。

1.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 將待測(cè)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞并用冰PBS 液洗滌3 次。用含1% Triton X-100 的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。收取總蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗為鼠抗人COX-2、CDX-2、p-P65 單克隆抗體及鼠抗人GAPDH 單克隆抗體，二抗為熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光顯色并測(cè)定反應(yīng)條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)值，重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所用方法為析因方差分析、單因素方差分析，組間多重比較用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 轉(zhuǎn)染效果 利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使COX-2 在HET-1A 細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)及基因沉默，48 h后收集細(xì)胞，用Western blot 檢測(cè)COX-2 表達(dá)，可見(jiàn)COX-2 轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

圖1 COX-2 在HET-1A 細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)及基因沉默后的表達(dá)Fig1 Expression of COX-2 in HET-1A cells after overexpression and gene silencing

2.2 酸、膽鹽和二者混合物誘導(dǎo)HET-1A 細(xì)胞凋亡 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鹽酸調(diào)整培養(yǎng)基PH 值，最終選取pH 值為6.0，作用時(shí)間30 min 干預(yù)細(xì)胞；膽鹽濃度選取1 200 μmol/L，作用時(shí)間30 min。根據(jù)酸和膽鹽濃度不同，實(shí)驗(yàn)分4組：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 7）、（0 μmol/L，pH 6）、（1 200 μmol/L，pH 6），流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡（圖2）。結(jié)果顯示，以上4 組凋亡率分別為（2.52±0.45）%、（7.23±0.62）%、（4.49 ± 0.45）%和（28.37 ± 1.57）%，酸、膽鹽及二者混合物均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，酸的作用最弱，混合物作用最強(qiáng)［（4.49 ± 0.45）%vs.（28.37 ± 1.57）%，P＜0.05）］。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)酸、膽鹽及二者混合物誘導(dǎo)的HET-1A 細(xì)胞凋亡Fig2 Apoptosis of HET-1A cells was induced by acid，bile salts and their mixture

2.3 在HET-1A 細(xì)胞內(nèi)酸、膽鹽和二者混合物增加了COX-2、p-P65和CDX-2的表達(dá) 根據(jù)前期結(jié)果設(shè)置分組為：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 7）、（0 μmol/L，pH 6）、（1 200 μmol/L，pH 6），干預(yù)HET-1A 細(xì)胞30 min，Western blot 檢測(cè)COX-2、p-p65及CDX-2的表達(dá)水平，見(jiàn)圖3，處理組COX-2、p-P65 及CDX2 的表達(dá)相比正常組均上調(diào)，膽鹽和鹽酸混合處理組上調(diào)最明顯。

2.4 基因沉默COX-2 對(duì)酸和膽鹽混合物誘導(dǎo)的HET-1A 細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)前期結(jié)果設(shè)置實(shí)驗(yàn)分3 組：（0 μmol/L，pH 7）、（1 200 μmol/L，pH 6）和siCOX-2（1 200 μmol/L，pH 6）。HET-1A 細(xì)胞轉(zhuǎn)染COX-2 siRNA，48 h 收樣檢測(cè)前取鹽酸pH 6.0 聯(lián)合1 200 μmol/L 的膽鹽處理30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（圖4），結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率分別為（3.69±0.44）%、（45.27±2.62）%和（53.67±1.26）%，基因沉默COX-2 后細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）。

圖3 在HET-1A 細(xì)胞內(nèi)酸、膽鹽和二者混合物增加了COX-2、p-P65 和CDX-2 的表達(dá)Fig.3 The expressions of COX-2，p-P65 and CDX-2 were increased in the presence of acid，bile salts and mixtures in HET-1A cells

圖4 基因沉默COX-2 增加酸和膽鹽混合物誘導(dǎo)的HET-1A 細(xì)胞凋亡Fig.4 Gene silencing COX-2 increased apoptosis of HET-1A cells after acid and bile salts mixtures induction

2.5 基因沉默COX-2 后酸和膽鹽混合物誘導(dǎo)的HET-1A 細(xì)胞內(nèi)COX-2、p-P65 和CDX-2 表達(dá)均減弱 細(xì)胞轉(zhuǎn)染COX-2 siRNA，48 h 收樣檢測(cè)前取鹽酸pH 6.0聯(lián)合1 200 μmol/L的膽鹽處理，HET-1A處理30 min，Western blot 檢測(cè)COX-2、p-P65 及CDX-2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖5），酸和膽鹽混合物處理細(xì)胞后COX-2、p-P65 和CDX-2 蛋白表達(dá)均上調(diào)，干擾COX-2 后以上蛋白表達(dá)均下降。

3 討論

目前研究認(rèn)為BE 多由嚴(yán)重而長(zhǎng)期的胃和十二指腸內(nèi)容物反流刺激食管下段所致，主要是酸和膽汁反流［6-7］。BE 來(lái)源于食管鱗狀細(xì)胞還是來(lái)源于干細(xì)胞有待研究，但多數(shù)認(rèn)為BE 可能由食管鱗狀細(xì)胞分化而來(lái)，BE 具體發(fā)生機(jī)制尚不明確［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)［11-12］，COX-2 在人BE 組織中表達(dá)明顯高于周?chē)[狀細(xì)胞及對(duì)照組組織，炎癥刺激后COX-2 在食管鱗狀細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，提示COX-2 可能在BE 發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

圖5 基因沉默COX-2 后酸和膽鹽混合物誘導(dǎo)的HET-1A細(xì)胞內(nèi)COX-2、p-P65 和CDX-2 表達(dá)均減弱Fig.5 Gene silencing COX-2 decreased the expression of COX-2、p-P65 and CDX-2 in the presence of acid and bile salts mixtures in HET-1A cells

本研究模擬人體酸和膽鹽環(huán)境，在酸、膽鹽及二者混合物作用下培養(yǎng)食管鱗狀細(xì)胞，探討COX-2對(duì)食管鱗狀細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)酸、膽鹽及二者混合物均可誘導(dǎo)HET-1A 細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中酸、膽鹽二者混合物的作用最強(qiáng)，其作用是單獨(dú)酸或膽鹽的數(shù)倍，可能二者聯(lián)合可以發(fā)揮協(xié)同作用。酸和膽鹽誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴隨COX-2 表達(dá)增強(qiáng)，基因沉默COX-2 后細(xì)胞凋亡增加，提示COX-2 參與調(diào)控了酸、膽鹽誘導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞凋亡，COX-2 可能參與了BE 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

NF-κB［13-14］作為炎癥反應(yīng)的重要表達(dá)因子，被認(rèn)為在炎癥發(fā)展到癌癥過(guò)程中起重要作用，NF-κB 在多種細(xì)胞、組織中參與細(xì)胞凋亡過(guò)程；研究發(fā)現(xiàn)［15］NF-κB 在BE 異型性、食管腺癌組織中表達(dá)增高，可能是通過(guò)激活生存素作為抗凋亡因子發(fā)揮作用。BUS 等［16］證實(shí)在食管鱗狀細(xì)胞中抑制NF-κB可以抑制細(xì)胞增殖，伴隨COX-2 表達(dá)降低。PARK等［17］發(fā)現(xiàn)在平滑肌瘤細(xì)胞中COX-2 抑制劑塞來(lái)昔布可以通過(guò)NF-κB 通路抑制細(xì)胞增殖。以上提示NF-κB 在BE 發(fā)生中起重要作用，NF-κB 與COX-2可互相調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2可誘導(dǎo)HET-1A細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

CDX做為尾型同源核轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是腸道發(fā)育過(guò)程中特異性表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化［18］。CDX-2 在BE 腸化生中起關(guān)鍵作用，其在食管中的表達(dá)是腸化生的早期特異性標(biāo)志［19］。本研究證實(shí)在HET-1A 細(xì)胞內(nèi)COX-2 可以調(diào)節(jié)CDX-2 表達(dá)，提示COX-2 可能在食管鱗狀細(xì)胞腸化過(guò)程中起重要的作用。

綜上所述，基因沉默COX-2 表達(dá)可以促進(jìn)酸、膽鹽誘導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是COX-2 通過(guò)調(diào)節(jié)p-P65 及CDX-2 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。提示COX-2 可能參與了BE 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，需要進(jìn)一步研究COX-2 在BE 發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制。