小兒紫癜疹消顆粒對(duì)過(guò)敏性紫癜患兒血清IgA1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的抑制機(jī)制研究

朱浩宇， 段曉征， 馮曉純

過(guò)敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura，HSP)是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的一種系統(tǒng)性血管炎疾病。發(fā)病機(jī)制以IgA介導(dǎo)的體液免疫異常為主，病理變化表現(xiàn)為廣泛的白細(xì)胞碎裂性小血管炎，在熒光顯微鏡下皮膚、胃腸道、腎臟等組織病理可見(jiàn)IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，因此本病也被稱為IgA血管炎[1]。這是由于HSP患兒血清IgA1分子結(jié)構(gòu)糖基化異常，使其自身聚集或與IgG等結(jié)合形成大分子免疫復(fù)合物而發(fā)生清除障礙，沉積于各組織器官引起自身炎癥反應(yīng)和組織損傷[2-3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒的血清可刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical venous endothelial cells，HUVECs)合成分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等，同時(shí)核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)增加，參與HSP的發(fā)病過(guò)程[4]。小兒紫癜疹消顆粒為馮曉純教授治療HSP經(jīng)驗(yàn)方劑，臨床研究證實(shí)其療效顯著，復(fù)發(fā)率低，且無(wú)不良反應(yīng)[5]。本研究以HUVECs為研究對(duì)象，給予HSP患兒血清IgA1刺激HUVECs發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)加入不同濃度的小兒紫癜疹消顆粒進(jìn)行干預(yù)，觀察小兒紫癜疹消顆粒對(duì)HSP患兒血清IgA1誘導(dǎo)HUVECs炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月至12月長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院收治的HSP患兒30例為觀察組，其中男14例，女16例；年齡5～12歲，平均年齡(7.27±3.68)歲。同期選取門診健康體檢兒童30例為對(duì)照組，其中男15例，女15例；年齡5～12歲，平均年齡(7.53±3.14)歲。兩組研究對(duì)象在年齡、性別方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2006年EULAR/PReS制定的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡5～12歲；(3)患兒為初次發(fā)?。?4)患兒家屬知情同意，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)已給予藥物治療者；(2)合并其他疾病者。

1.5 細(xì)胞、主要試劑和儀器 HUVECs購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；小兒紫癜疹消顆粒(主要成分：紫草、生地、牡丹皮、白薇、白鮮皮、黃芩、側(cè)柏葉、茜草、雞血藤)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心提供；IL-8和TNF-α(美國(guó)Santa CRUZ公司)；NF-κB(英國(guó)Abcam公司)。

1.6 血清IgA1的分離提取 所有兒童于清晨空腹采外周靜脈非抗凝全血5 mL，室溫下放置2 h后，離心機(jī)4 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，提取上清放于-80 ℃低溫冰箱中保存。將血清樣品用去離子水按照體積比為1∶1稀釋后，加入固體硫酸銨使其飽和度為50%，12 000 r/min，4 ℃離心10 min(離心半徑10 cm)，留沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解后，透析至磷酸鹽緩沖液中；用磷酸鹽緩沖液平衡凝集素柱子，平衡5個(gè)柱體積；上樣，以0.5 mL/min的流速過(guò)凝集素柱子；洗雜，用磷酸鹽緩沖液洗脫除去未結(jié)合的蛋白；洗脫，用0.8 mol/L凝集素的磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)HD-2004型紫外檢測(cè)儀讀數(shù)收集目的蛋白。洗脫的目的蛋白透析至磷酸鹽緩沖液中；將透析好的樣品以0.5 mL/min的流速過(guò)pro A柱子；用pH=3.0的50 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，收集目的蛋白；取透析好的樣品20 μL，加20 μL的2倍濃縮的上樣緩沖液，沸水煮4 min，上樣檢測(cè)。

1.7 HUVECs傳代培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清的1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入含0.02%乙二胺四乙酸的0.25%胰酶消化液，37 ℃消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙變大即加入含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)。用移液管吹打瓶壁使細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸濁液置于無(wú)菌離心管中，1 000 r/min離心4 min(離心半徑10 cm)，棄上清，加入完全培養(yǎng)液將沉淀懸浮，以1∶3接種于新培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)至致密單層時(shí)可再次傳代。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞依培養(yǎng)條件不同隨機(jī)分為6組(每組10孔)：(1)空白對(duì)照組：用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)HSP組：用含HSP患兒200 mg/L血清IgA1培養(yǎng)液培養(yǎng)；(3)低、中、高濃度中藥組：HUVECs于含HSP患兒200 mg/L血清IgA1培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)分別加入濃度為25、50、100 mg/L的小兒紫癜疹消顆粒；(4)對(duì)照組：用含正常兒童200 mg/L血清IgA1培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-8、TNF-α水平 建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1∶1稀釋，加入稀釋后的標(biāo)本50 μL于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)。再加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，混勻，37 ℃溫育60 min；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，向?yàn)V紙上印干；每孔加入80 μL的親和鏈酶素-辣根過(guò)氧化物酶，混勻，37 ℃溫育30 min；再次用洗滌液充分洗滌5次；每孔加入底物A、B各50 μL，混勻，將反應(yīng)板置37 ℃暗處反應(yīng)10 min；每孔加入50 μL終止液混勻，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值，計(jì)算標(biāo)本IL-8、TNF-α定含量。

1.10 Western blot檢測(cè)HUVECs中NF-κB蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液低溫裂解。12 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，取上清，檢測(cè)各樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，加入NF-κB抗體4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(GAPDH，稀釋比例為1∶2 000)，室溫封閉1 h。在膜表面均勻滴加化學(xué)發(fā)光液，避光反應(yīng)1～2 min。用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)的相對(duì)含量以目的蛋白與GAPDH條帶平均灰度值的比值表示，按計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 小兒紫癜疹消顆粒對(duì)各組HUVEC分泌IL-8、TNF-α水平的影響 見(jiàn)表1。

表1 小兒紫癜疹消顆粒對(duì)各組HUVECs分泌TNF-α及IL-8水平的影響

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與HSP組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，HSP組TNF-α、IL-8水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與HSP組比較，低、中、高濃度中藥組TNF-α、IL-8水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著小兒紫癜疹消顆粒濃度增大，TNF-α、IL-8水平逐漸下降。

2.2 小兒紫癜疹消顆粒對(duì)各組HUVECs的NF-κB(P65)蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。

表2 小兒紫癜疹消顆粒對(duì)各組HUVECs的NF-κB(P65)蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與HSP組比較，bP<0.05。

表2結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，HSP組P65蛋白顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HSP組比較，高濃度中藥組P65蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Western blot檢測(cè)各組HUVECs的NF-κB(P65)蛋白電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)各組HUVECs的NF-κB(P65)蛋白電泳圖

3 討論

HSP作為兒童期常見(jiàn)的一種自身免疫性疾病，至今仍無(wú)理想的治療方法。HSP發(fā)生小血管炎癥病變，血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到損害。故選擇性保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向治療已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞方便取材，充足的來(lái)源，是構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的常用材料。本研究通過(guò)觀察小兒紫癜疹消顆粒對(duì)HSP患兒血清IgA1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVEC炎癥反應(yīng)的影響，為中藥治療小兒HSP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

IL-8是趨化性細(xì)胞因子家族成員，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，具有抗感染、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等重要功能。無(wú)論是特異性還是非特異性的免疫細(xì)胞，IL-8具有強(qiáng)烈的趨化作用，其與嗜中性粒細(xì)胞上的IL-8受體結(jié)合后，導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的遷移和活化，從而導(dǎo)致血管炎癥的發(fā)生[15-17]。Yang等[18]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒血清中IL-8水平升高，并多由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。本研究顯示，與HSP組相比，低、中、高濃度中藥組IL-8水平明顯降低。隨著小兒紫癜疹消顆粒濃度增大，IL-8水平逐漸下降。從實(shí)驗(yàn)中推測(cè)小兒紫癜疹消顆粒在人體內(nèi)通過(guò)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8，使中性粒細(xì)胞在炎癥灶內(nèi)浸潤(rùn)減少，抑制其釋放蛋白水解酶和產(chǎn)生氧自由基，減輕局部炎癥。

TNF-α作為一種強(qiáng)有力的促炎性細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，能誘導(dǎo)多種信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞炎癥和凋亡[19-20]。TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬和黏附作用，又可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞間黏附分子，促進(jìn)白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，從而直接和間接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。陳鐵龍等[21]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能顯著增加HUVECs的凋亡和炎癥因子表達(dá)，其損傷機(jī)制可能是通過(guò)激活NF-κB、AP-1途徑，并抑制eNOS的釋放有關(guān)。華冉等[22]研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒急性期、恢復(fù)期的NF-κB都與TNF-α呈正相關(guān)，證明TNF-α可激活NF-κB，而NF-κB活化后又進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α分泌，TNF-α對(duì)NF-κB活化具有正反饋?zhàn)饔?。本研究顯示，與HSP組相比，低、中、高濃度中藥組TNF-α水平明顯降低。隨著小兒紫癜疹消顆粒濃度增大，TNF-α水平逐漸下降。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)小兒紫癜疹消顆粒在人體內(nèi)通過(guò)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α，從而減輕血管炎癥反應(yīng)。

NF-κB為參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控機(jī)體多種黏附分子、細(xì)胞因子等表達(dá)[23-24]。生理狀態(tài)下NF-κB的p65亞基與其抑制蛋白IκB結(jié)合，于細(xì)胞質(zhì)中以無(wú)活性狀態(tài)存在。在多種因素作用下激活I(lǐng)κB蛋白激酶，導(dǎo)致IκB發(fā)生磷酸化并迅速降解，從而與NF-κB發(fā)生解離，暴露出p65亞基的核定位信號(hào)區(qū)域，導(dǎo)致NF-κB活化并轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)核內(nèi)炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)?；罨蟮腘F-κB能增強(qiáng)TNF-α、IL-8的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)這些因子增多后又可以活化NF-κB，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。本研究顯示，與HSP組相比，高濃度中藥組P65蛋白水平明顯降低。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)小兒紫癜疹消顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中P65蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制下游基因表達(dá)，達(dá)到抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的作用。

本研究表明，小兒紫癜疹消顆?？梢砸种艸SP患兒血清IgA1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVECs分泌炎癥介質(zhì)，并與小兒紫癜疹消顆粒的劑量呈負(fù)相關(guān)。小兒紫癜疹消顆粒抑制HSP患兒血清IgA1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVECs分泌炎癥介質(zhì)的分子機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB基因表達(dá)，從而減少細(xì)胞炎癥介質(zhì)因子IL-8、TNF-α等釋放有關(guān)，小兒紫癜疹消顆粒能否通過(guò)其他途徑抑制HUVECs炎癥反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。