甲基營養(yǎng)菌Methylobacterium extorquens AM1中最適熒光蛋白報告基因的鑒定

朱麗萍 劉聰聰 宋書真 刁斌

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，青島 266109）

甲基營養(yǎng)菌是一類廣泛存在的可利用一碳化合物作為唯一碳源的微生物類群，其模式菌株M.extorquens AM1已成為研究微生物進化和合成代謝的良好材料［1-4］，但受該菌遺傳背景的影響，目前只有一套基于IncP復(fù)制子的遺傳質(zhì)粒操作系統(tǒng)［5-6］，因此多元化的標記基因開發(fā)是開展遺傳操作工作的基礎(chǔ)，而高效穩(wěn)定的遺傳標記基因尤為重要。

熒光蛋白基因是一類廣泛應(yīng)用的報告基因，可通過對熒光強度的檢測，表征細胞內(nèi)一個或多個基因的表達水平。1962年Shimomura首次從水母（Aequorea victoria）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），1999年 Matz等［7］從珊瑚中分離到紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein，RFP），靈敏度和信噪比均比GFP高，但是具有成熟慢、易聚合和對細胞有一定的毒性等特性限制其應(yīng)用，而后出現(xiàn)的一系列優(yōu)化突變體尤以mCherry成熟快、單體性好，被廣泛應(yīng)用［8］。目前熒光蛋白按波長可分為深藍色、藍色、青色、綠色、黃色、橙色、紅色、深紅色和近紅外系列等40多種，激發(fā)/發(fā)射波長范圍從355/424 nm到684/708 nm［9-10］。綠色熒光蛋白eGFP因其靈敏度高，不需要其他輔助底物就能產(chǎn)生較強的熒光，且對細胞無毒害作用，不影響其他蛋白的表達，穩(wěn)定性好，已在微生物、植物、動物中獲得成功表達。在M. extorquens菌株中已報道表達的熒光蛋白有mCherry和GFP，其中mCherry表達顯著，在熒光成像、熒光定位及基因表達強度鑒定方面表現(xiàn)出良好的特征［6，11］，而綠色熒光蛋白的種類多達6種以上［5，12-15］。以上研究報道所涉及的熒光檢測手段和取樣測定點都不盡相同，熒光強度表征方式也不一而足，熒光蛋白之間沒有詳盡的熒光表達分析，因此各熒光基因在M. extorquens AM1中表達是否穩(wěn)定，以及熒光強度在菌株生長過程中的變化趨勢尚不明確。截至目前，其他熒光報告基因的使用在M.extorquens未見報道。

為進一步明確熒光報告基因在甲基營養(yǎng)菌生長過程中的表達變化，篩選最適的熒光報告基因，我們克隆了實驗室現(xiàn)有的五種熒光基因egfp、yfp、wgfp、mcherry、rfp，利用甲基營養(yǎng)菌中常用的強啟動子PmxaF控制表達［16］，轉(zhuǎn)化至M. extorquens AM1后篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子并進行測定和比較分析；借助先進的細胞微孔板成像儀器cytation5［17-18］分別對其熒光成像和熒光表達強度的測定，獲得熒光成像展示及熒光表達水平分析；結(jié)合SDS-PAGE蛋白凝膠電泳確證熒光基因都能表達出相應(yīng)的蛋白；通過相對熒光強度和穩(wěn)定性比較，最終確定最優(yōu)的熒光蛋白報告基因yfp，為后續(xù)實驗中熒光標記基因的選擇及熒光檢測提供借鑒和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

甲基營養(yǎng)菌M. extorquensAM1和大腸桿菌E.coliDH5α均由本實驗室保藏。質(zhì)粒pCM80是可在大腸桿菌和甲基營養(yǎng)菌中復(fù)制的質(zhì)粒，為本實驗室保藏。pX458、pSWU-YFP、pSCV1-2、pSWU-mCherry、pSCV1-RFP質(zhì)粒分別攜帶egfp、yfp、wgfp、mcherry、rfp熒光基因，來自購買或饋贈。

DH5α感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增，培養(yǎng)與保藏用LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、Nacl 10 g/L，37℃培養(yǎng)。M. extorquensAM1菌株的培養(yǎng)采用Hypho培養(yǎng)基，具體配制方法參照文獻［19］，30℃條件下培養(yǎng)。所需抗生素四環(huán)素（tet，終濃度10 μg/mL）。分子克隆相關(guān)酶、DNA片段及質(zhì)粒抽提純化試劑盒購于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 多種熒光報告基因差異比對及PCR擴增 將本論文所用的五種熒光基因通過Bioedit中的clastalW軟件進行DNA序列和編碼蛋白比對分析，標記差異位點，設(shè)計通用引物對Fluo-F和Fluo-R，分別以質(zhì)粒pSWU-mCherry、pX458、pSWU-YFP為模板進行PCR擴增mcherry、egfp、yfp的基因序列；設(shè)計RFP-F和RFP-R為引物對，以pSCV1-RFP質(zhì)粒為模板，PCR擴增rfp序列；設(shè)計wGFP-F和wGFP-R引物對，以pSCV1-2質(zhì)粒為模板PCR擴增wgfp序列。相關(guān)引物序列信息見表1。

1.2.2 熒光報告基因重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將PCR擴增得到的五種熒光基因片段用KpnⅠ-EcoRⅠ雙酶切純化回收后，分別與同樣酶切的pCM80質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建含有熒光報告基因的重 組 載 體 pCM80-egfp、pCM80-yfp、pCM80-wgfp、pCM80-mcherry和pCM80-rfp，并測序驗證。將重組質(zhì)粒與對照質(zhì)粒pCM80分別電轉(zhuǎn)化至M. extorquensAM1感受態(tài)細胞中，參數(shù)設(shè)定：1 800 V；1 mm電轉(zhuǎn)杯；2 μL質(zhì)粒混合50 μL感受態(tài)細胞；電擊時間5 ms。在含有四環(huán)素的固體平板上篩選重組轉(zhuǎn)化子，用于后續(xù)的分析鑒定。

1.2.3 重組菌株生長曲線測定 將固體平板上的重組菌株單菌落轉(zhuǎn)移到含有3 mL Hypho液體培養(yǎng)基，成像微孔板檢測系統(tǒng)-Cytation 5（BioTek）中，選擇熒光檢測，安裝熒光濾光片（通道1：EX485/20，EM528/20；通道 2：EX530/25，EM590/35），選取96孔板上相應(yīng)的讀取范圍，測定熒光強度值，同時測定每孔的OD600值，則相對熒光強度=Δ熒光值/ΔOD600，即為熒光表達水平。測定前先測定900 nm和977 nm的吸收值（Abs900，Abs977），通過公式（Abs977-Abs900）/0.18將光程校正到1 cm對應(yīng)的OD600的值。30℃、200 r/min，培養(yǎng)至指數(shù)期（OD600約0.6-0.8），轉(zhuǎn)至含100 mL Hypho液體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液初始OD600=0.01，30℃、200 r/min培養(yǎng)，定時取菌用紫外分光光度計測定OD600值，直至OD600值開始出現(xiàn)下降為止，每個菌株3個生物學(xué)重復(fù)。

表1 本論文所用引物信息

1.2.4 重組子熒光成像觀察 挑取重組菌株的單菌落接入帶有Hypho液體培養(yǎng)基的試管中進行培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)到0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的菌液200 μL，離心去上清，洗滌2次，用同樣體積的無菌水重懸，取20 μL加在烘干的載玻片上并加覆蓋玻片，放入玻片適配器中，利用細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)-Cytation 5（BioTek）進行熒光成像檢測，通過Gen5軟件設(shè)定物鏡觀察范圍，先自動聚焦再手動聚焦，并在［Brightfield（明場）］下找到菌體細胞，進而切換至相應(yīng)的熒光場［Red：586，647］、［Green：469，525］下微調(diào)節(jié)焦距進行成像觀察，拍照保存并分析。

1.2.5 熒光報告基因的蛋白SDS-PAGE電泳檢測 將50 mL的重組菌株的液體發(fā)酵液培養(yǎng)至OD600=0.8，收集菌體，離心洗滌，重懸于5 mL Tris-HCl（100 mmol/L，pH=8.0），在 4℃下，用 French press細胞破碎儀38 kPa破碎至澄清，制備粗酶液，離心，分離上清和細胞碎片沉淀（沉淀加適量無菌水重懸），分別取粗酶液、上清和細胞沉淀與上樣緩沖液混合，采用SDS-PAGE（5%濃縮膠和10%分離膠）進行電泳檢測，用考馬斯亮藍R-250染色觀察熒光蛋白的表達。

1.2.6 相對熒光表達強度測定 根據(jù)生長曲線取點，測定菌株在相應(yīng)時間和OD下熒光表達強度。每次取200 μL菌液加至96微孔板中，加載至細胞

2 結(jié)果

2.1 5種熒光蛋白基因的比對分析

5種 熒 光 蛋 白 eGFP、YFP、wGFP、mCherry和RFP，分別獲得其基因序列和蛋白質(zhì)序列，利用Bioedit軟件中的ClustalW多序列比對模塊分析發(fā)現(xiàn)，egfp與yfp的基因序列僅有9個堿基的差異，一致性達98.75%（堿基數(shù)比：711/720）（圖1-A）；而mcherry的基因序列雖與egfp/yfp存在較大的堿基差異，但在5′端和3′端各有21 bp和25 bp的同源序列（圖1-A）。rfp與mcherry的基因序列一致性為97%（644/661）（圖1-B）。wgfp與egfp的一致性較低，核心序列一致性為77.1%（196/254）。進一步分析相應(yīng)的熒光蛋白序列發(fā)現(xiàn)：YFP、wGFP分別與eGFP蛋白序列一致性為97.9%（234/239）和95.8%（229/239）（圖1-C）；RFP作為單分子紅色熒光蛋白與mCherry的蛋白序列一致性為90.8%（217/239）（圖1-D），而YFP、eGFP和wGFP分別與mCherry的一致性為28.8%-29.2%，與RFP為25.6%-26.5%，由此可見同色系列的熒光蛋白相似度很高。進一步對熒光蛋白的生色基團進行分析，已知eGFP是在野生型GFP基礎(chǔ)上將原有的生色基團Ser65-Tyr66-Gly67（S-Y-G）中的Ser65突變?yōu)門hr65，即生色團為T-Y-G，使得熒光強度提高了5倍［20］。在本實驗中黃色熒光蛋白YFP相應(yīng)位點分別為G-Y-G，另一個酵母菌優(yōu)化可用的wGFP蛋白在此處為S-Y-G，與野生型GFP位點相一致（圖1-C），推測其熒光強度會偏低。

2.2 熒光報告基因在甲基營養(yǎng)菌中的成像檢測

圖1 熒光蛋白基因序列比對結(jié)果

將含有熒光基因的重組質(zhì)粒pCM80-egfp、pCM80-yfp、pCM80-wgfp、pCM80-mcherry和 pCM80-rfp，電轉(zhuǎn)化至M. extorquensAM1感受態(tài)細胞中，挑選轉(zhuǎn)化子進行熒光成像觀察。菌株整體成像結(jié)果（圖2）顯示，eGFP、YFP、wGFP和mCherry熒光活性較為顯著，RFP則幾乎看不到熒光。從4 d內(nèi)的定點取樣成像結(jié)果來看，0 h在Green和Red通道下相應(yīng)的背景顏色比較高，不能檢測到熒光；24 h的細胞培養(yǎng)物雖然菌落密度較低但已顯示出很強的熒光；48-72 h細胞密度增加、熒光強度趨于穩(wěn)定；96 h熒光強度開始下降，細胞密集，推測由于此時期內(nèi)（衰退期）細胞裂解所致。含有pCM80質(zhì)粒的菌株作為陰性對照，在培養(yǎng)后期出現(xiàn)了熒光點，推測與培養(yǎng)基殘留及細胞代謝內(nèi)溶物釋放產(chǎn)生的背景干擾有關(guān)。

為進一步探究Cytation5對不同熒光蛋白的辨別度，將含有pCM80-egfp、pCM80-mcherry及pCM80的菌株混合后制片，選擇同一視野分別在［Bright Field］、［Red ：586，647］、［Green：469，525］ 通道下成像，通過圖像堆疊功能形成細胞成像差異圖。結(jié)果顯示當Red和Green疊加后，能有效檢測出含有mCherry和eGFP蛋白的細胞（圖3-A）；三場疊加后，對照細胞（黑色）也被顯示出來（圖3-B）。三種細胞間沒有交集，均能明顯分離。

2.3 熒光報告基因在甲基營養(yǎng)菌中蛋白表達鑒定

將 pCM80-egfp、pCM80-mcherry和 pCM80重組轉(zhuǎn)化菌株進行液體培養(yǎng)至OD600=0.8，收集菌體高壓破碎，取細胞破碎液全液（粗酶液）、破碎液離心后的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果重組菌株細胞破碎液全液和上清中在相對分子質(zhì)量約27 kD處可見特異性的蛋白條帶，與預(yù)期大小相符（圖4）。進一步對所有重組轉(zhuǎn)化菌株細胞破碎液離心后的上清取樣檢測，均能檢測到相應(yīng)的目的條帶（圖5，其中RFP略小為25.4 kD）。表明熒光蛋白在甲基營養(yǎng)菌內(nèi)都有表達。

2.4 熒光基因表達強度鑒定

為鑒定最優(yōu)的熒光報告基因，測定了重組菌株的生長曲線和熒光基因表達強度值。從生長曲線（圖6-A）來看，含有熒光基因的各轉(zhuǎn)化子與對照pCM80轉(zhuǎn)化子生長基本一致，熒光蛋白的表達未對菌株生長產(chǎn)生抑制。進一步測定各培養(yǎng)時期熒光量總值如圖6-B所示，當OD600=0.1（12 h），熒光總量顯著增加，OD600=1.5左右（48 h）熒光總量達到最大，之后趨于穩(wěn)定；菌株整體熒光量變化趨勢與細胞OD600變化相一致，可見熒光蛋白的表達在細胞生長過程中相對比較穩(wěn)定。熒光蛋白的整體熒光量程度比較為 ：YFP ＞ eGFP ＞ mCherry ＞ wGFP ＞ RFP。

分析每個熒光蛋白的相對熒光強度曲線（圖6-C）發(fā)現(xiàn)，在指數(shù)前期（24 h；OD600≈0.4）相對熒光強度最高，指數(shù)中期（36 h；OD600≈1.0）之后，相對熒光強度趨于穩(wěn)定。YFP最大相對熒光強度是eGFP的1.6倍，而wGFP最大相對熒光強度僅為eGFP的0.1倍，mCherry是eGFP的0.47倍，RFP的熒光強度痕量。0-6 h，細胞處于延滯期，此時相對熒光均有下降，可計算出熒光蛋白半衰期分別 是 eGFP（9.1 h）、YFP（10.9 h）、wGFP（8.5 h）和mCherry（10.2 h），YFP的穩(wěn)定性最高。

綜上，在甲基營養(yǎng)菌中表達強度最明顯的熒光蛋白是YFP，其次為eGFP和mCherry，wGFP熒光相對較弱，而 RFP在甲基菌僅痕量。

3 討論

甲基營養(yǎng)菌由于受宿主背景和遺傳操作工具的限制，需要不斷開發(fā)和應(yīng)用具有廣宿主特性的遺傳和分子模塊，而高效穩(wěn)定可靠的報告基因也是研究的重點，甲基營養(yǎng)菌中雖有利用綠色熒光蛋白和mCherry 的研究［5，6，11-15］，但僅限于用作篩選標記或報告基因指征一個或多個基因的表達水平，缺乏其內(nèi)熒光蛋白之間相對熒光強度及表達穩(wěn)定性的比較分析。因此，本論文將5種不同來源的熒光蛋白基因分別在M. extorquensAM1中表達，通過目的蛋白檢測、熒光成像展示及熒光動態(tài)表達強度測定，指征熒光蛋白的表達水平，進一步分析比較各熒光蛋白性能。在M. extorquensAM1中各熒光蛋白的熒光強度順序為 ：YFP ＞ eGFP ＞ mCherry ＞ wGFP。RFP雖與mCherry蛋白序列相似度高，但在同樣情況下沒有檢測到熒光，推測受宿主特性的影響，RFP蛋白在M. extorquensAM1中未能正確折疊或表達后無熒光活性，不適合應(yīng)用于甲基營養(yǎng)菌。據(jù)文獻報道，黃色熒光蛋白YFP是最強的熒光蛋白之一，其熒光強度是eGFP的1.5倍，紅色熒光中mCherry熒光強度是eGFP的0.43倍［10］。本研究中YFP和mCherry的最大相對熒光強度分別是eGFP的1.6倍和0.47倍，與文獻報道一致，可見三者具有較為廣泛的宿主表達特性及穩(wěn)定性。相比于常用的eGFP和mCherry，M.extorquensAM1中YFP表現(xiàn)出更好的熒光特性。

圖2 重組菌株的熒光成像觀察

圖3 pCM80-egfp、pCM80-mcherry和pCM80重組轉(zhuǎn)化菌株的疊加熒光成像

圖4 熒光蛋白電泳檢測

圖5 所有熒光蛋白電泳檢測

圖6 菌株生長曲線及熒光強度檢測

進一步通過熒光總量、相對熒光強度曲線和細胞生長曲線的分析發(fā)現(xiàn)：熒光總量與細胞的OD值變化相一致，最大熒光量出現(xiàn)在穩(wěn)定期之前，之后保持穩(wěn)定，表明熒光蛋白在M. extorquensAM1中穩(wěn)定性強；相對熒光強度最大值出現(xiàn)在指數(shù)期前期，指數(shù)后期之后趨于穩(wěn)定，表明相對熒光強度在細胞培養(yǎng)過程中并非一成不變而是處于動態(tài)變化之中，這是由細胞生長狀態(tài)及熒光蛋白成熟后熒光衰減共同導(dǎo)致，根據(jù)此曲線可依不同的研究目的在細胞生長相應(yīng)時期進行取點檢測熒光。各熒光蛋白的半衰期在8.5-10.9 h之間，其中YFP半衰期最長，與eGFP相比不論是熒光強度還是穩(wěn)定性都要強。mCherry比eGFP的半衰期略長，熒光強度低，但相比于RFP，是紅色熒光蛋白的良選。

4 結(jié)論

在甲基營養(yǎng)菌中成功表達了5種不同的熒光蛋白基因，并對其蛋白表達、熒光成像及熒光強度進行了檢測、鑒定和細致分析，最終確定黃色熒光蛋白YFP的熒光穩(wěn)定性及相對熒光強度都是最優(yōu)的。