• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    融合蛋白基因與抗體基因電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的條件摸索優(yōu)化

    2019-05-09 06:57:44鄧曉芬楊曉佳易天紅馮英柯瀟賴維莉
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒用量條件

    鄧曉芬 楊曉佳 易天紅 馮英 柯瀟 賴維莉

    (成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品技術(shù)中心,成都 610036)

    近年來,全球藥物研發(fā)的重心正在從小分子化藥向生物大分子藥物轉(zhuǎn)移,比如抗體、疫苗、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、凝血因子和酶等,其中大部分為蛋白類藥物。由于多數(shù)蛋白類藥物分子量較小,半衰期短,為了延長(zhǎng)藥物的半衰期,蛋白融合技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1]。融合蛋白藥物是利用基因工程技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子與其他天然蛋白融合而產(chǎn)生的新型蛋白類藥物。與傳統(tǒng)的蛋白類藥物相比,融合蛋白藥物具有雙功能性[2],既提高了功能蛋白的穩(wěn)定性,延長(zhǎng)在體內(nèi)的代謝時(shí)間,又融合多個(gè)功能片段,形成高效靶向藥物。

    繼重組蛋白藥物之后,重組抗體藥物引領(lǐng)了第2次生物醫(yī)藥產(chǎn)品浪潮,是今后若干年新藥研發(fā)的主要方向[3]。重組抗體是指利用重組DNA技術(shù)或是基因突變的方法改造某種抗體基因的編碼序列,使之產(chǎn)生出自然界中原本不存在的抗體蛋白分子[4]。重組抗體類藥物從組成上分為兩類,一類是抗體本身,而另一類是由抗體本身與治療藥物(如放射性核素,毒素等)結(jié)合構(gòu)成。

    隨著生物藥物的發(fā)展,各種重組蛋白表達(dá)平臺(tái)也在發(fā)展,其中CHO細(xì)胞是表達(dá)重組蛋白(特別是融合蛋白和基因工程抗體)最常用的宿主之一[5-6],而重組蛋白基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá),最關(guān)鍵的步驟便是基因的轉(zhuǎn)染。目前常用的轉(zhuǎn)染方法主要有電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法等[7]。電轉(zhuǎn)染法相比其他轉(zhuǎn)染技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn),電轉(zhuǎn)染幾乎適用于所有細(xì)胞,但是不同的電轉(zhuǎn)染條件,會(huì)導(dǎo)致外源基因的轉(zhuǎn)染效率不同,即便在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞,不同的外源基因,轉(zhuǎn)染效率也會(huì)有所差別。本研究旨在摸索編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)染條件,并對(duì)比在最優(yōu)電轉(zhuǎn)條件下兩分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果,為后續(xù)電轉(zhuǎn)染重組融合蛋白和重組抗體分子提供一定的數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體融合蛋白表達(dá)載體pCMVi-VEGFR(由VEGFR1中的免疫球蛋白樣區(qū)域2和VEGFR2中的免疫球蛋白樣區(qū)域3,與人免疫球蛋白 Fc片段經(jīng)過融合而成),抗腫瘤壞死因子-α抗體表達(dá)載體pCMVi-TNF-α由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司構(gòu)建并保存。CHO-S細(xì)胞,購(gòu)自美國(guó)Life TechnologyTM公司。

    1.1.2 主要試劑及儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司,限制性內(nèi)切酶FspⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司,細(xì)胞培養(yǎng)基CD FortiCHO、Anticlumping agent、L-Glutamine均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,電轉(zhuǎn)儀Amaxa Nucleofector-II及試劑盒Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V購(gòu)自瑞士Lonza公司,紫外分光光度計(jì)Nanovue購(gòu)自美國(guó)GE公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Vi-cell購(gòu)自美國(guó)Beckman公司,Octet Qke Refurb檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Pall公司,CloneMedia-CHO、高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司,CO2培養(yǎng)箱Forma371購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司,細(xì)胞培養(yǎng)搖床ISF1-X購(gòu)自瑞士科耐公司。

    1.2 方法

    1.2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及線性化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒菌種擴(kuò)大培養(yǎng),按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說明書的方法提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒的線性化,37℃過夜酶切后回收質(zhì)粒,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的線性化程度,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒DNA濃度后于-20℃保存待用。

    1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞用125 mL搖瓶,于120 r/min,36.5℃,5% CO2搖床培養(yǎng),每2-3 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以2×105vc/mL傳代,培養(yǎng)體積為30 mL,細(xì)胞傳代培養(yǎng)基配制:1 L CD FortiCHO培養(yǎng)基加入40 mL L-Glutamin 和 10 mL Anti-clumping agent,4℃保存,使用前室溫預(yù)熱。

    1.2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)條件的摸索 將線性化的重組質(zhì)粒進(jìn)行以下電轉(zhuǎn)染條件的摸索:電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量,具體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,首先在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,質(zhì)粒用量為10 μg/孔的前提下,摸索并確定最佳的電轉(zhuǎn)染程序(U-023、U-024、U-030),接著利用最佳的電轉(zhuǎn)染程序,在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔的前提下,摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的質(zhì)粒用量(5、10、15、20 μg/孔),最后在最佳的電轉(zhuǎn)染程序和最佳的質(zhì)粒用量前提下,摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的細(xì)胞用量(1×107、1.5×107、2×107個(gè)/孔)。電轉(zhuǎn)染前,6孔板中各加入2.5 mL細(xì)胞傳代培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱;取CHO-S細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算使用的細(xì)胞體積;電轉(zhuǎn)染按Amaxa Cell line Nucleofector kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行;電轉(zhuǎn)染后,6孔板置于36.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),48 h后取0.5 mL細(xì)胞液檢測(cè)細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度,另取0.5 mL細(xì)胞液1000 r/min離心5 min,上清用Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)量,綜合細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)量判斷最佳電轉(zhuǎn)染條件,并最終對(duì)比融合蛋白與抗體表達(dá)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效果。

    1.2.4 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行轉(zhuǎn)染后重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到最佳密度5000 cells/mL;已融化的半固體培養(yǎng)基CloneMedia中加入其它成分,配成100 mL體積:90 mL CloneMedia+7 mL水+1 mL CloneDetect+2 mL Clone XL Reagent;將稀釋好的細(xì)胞液加入到配好的CloneMedia中,混勻后接種6孔板,2 mL/孔,37℃,5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后,觀察每個(gè)孔長(zhǎng)出的克隆數(shù),間接判斷細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

    表 1 電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2 結(jié)果

    2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒提取及線性化結(jié)果

    質(zhì)粒按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒方法提取,得到的質(zhì)粒濃度和純度均較高,見表2,用限制性內(nèi)切酶FspⅠ酶切后,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的線性化程度,見圖1,結(jié)果顯示質(zhì)粒線性化成功,可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

    2.2 電轉(zhuǎn)染條件摸索試驗(yàn)結(jié)果

    將編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分子線性化后,轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,分別對(duì)兩種分子的電轉(zhuǎn)程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量進(jìn)行摸索。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其活率、密度,Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)量,通過對(duì)比細(xì)胞的狀態(tài)及蛋白表達(dá)量來確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖2。

    表2 重組表達(dá)質(zhì)粒濃度及純度

    圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化程度

    采用不同的電轉(zhuǎn)染程序(U-023、U-024、U-030)電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞,48 h后檢測(cè)細(xì)胞的活率(2-A)、細(xì)胞的密度(2-B)及細(xì)胞的蛋白表達(dá)量(2-C),結(jié)果發(fā)現(xiàn)U-030程序下細(xì)胞的密度雖然最低,但與其他電轉(zhuǎn)程序下的細(xì)胞密度相比,差異并不是特別明顯,且該細(xì)胞的蛋白表達(dá)量最高,因此確定最佳電轉(zhuǎn)染程序?yàn)閁-030;同理對(duì)電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的用量進(jìn)行摸索(2-D-F),確定最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔;對(duì)電轉(zhuǎn)染細(xì)胞的用量進(jìn)行摸索(2-G-I),確定最佳的細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-030,最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔,最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔??贵w重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖3,其中包括對(duì)電轉(zhuǎn)程序的摸索結(jié)果(3-A-C)、質(zhì)粒用量的摸索結(jié)果(3-D-F)及細(xì)胞用量的摸索結(jié)果(3-G-I),最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-024,最佳質(zhì)粒用量為15 μg/孔,最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,兩分子的最佳轉(zhuǎn)染條件匯總見表3。

    表3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒的最佳電轉(zhuǎn)條件匯總

    圖2 融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

    根據(jù)電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果,兩個(gè)重組質(zhì)粒均采用最佳條件電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,48 h后對(duì)細(xì)胞的活率、細(xì)胞的密度及蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖4。電轉(zhuǎn)后兩者的細(xì)胞活率(4-A)差異不大,抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度稍高于融合蛋白重組質(zhì)粒(4-B),且細(xì)胞的蛋白表達(dá)量也更高(4-C),證明抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果略優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    2.4 半固體培養(yǎng)間接檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

    將采用最佳條件電轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞48 h后進(jìn)行半固體培養(yǎng)基接種,培養(yǎng)一段時(shí)間后采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行熒光成像,檢測(cè)兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的陽(yáng)性克隆數(shù)。結(jié)果如圖5,表達(dá)抗體的重組細(xì)胞形成的陽(yáng)性克隆個(gè)數(shù)多于融合蛋白重組細(xì)胞(圖5-A),且根據(jù)平均外部熒光強(qiáng)度判斷,抗體重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆的熒光強(qiáng)度高于融合蛋白重組細(xì)胞(圖5-B、5-C),與2.3的結(jié)果趨勢(shì)一致,再一次證明了抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    圖 3 抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖4 融合蛋白重組質(zhì)粒與抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

    3 討論

    目的基因能否進(jìn)行表達(dá),取決于表達(dá)質(zhì)粒能否成功轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)染作為重組生產(chǎn)用細(xì)胞株篩選的第一步,也是最重要的一步。目前常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要有物理方法、化學(xué)方法及生物方法[8],電轉(zhuǎn)染作為物理轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用非常廣泛,幾乎適用于所有細(xì)胞類型。但是不同的細(xì)胞系有不同的最佳轉(zhuǎn)染條件,即使是相同的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染入不同的外源基因,也會(huì)有不同的最佳條件,況且不同的實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染效率也有所不同[9],因此需對(duì)不同的基因,細(xì)胞類型,用量,轉(zhuǎn)染條件等因素進(jìn)行摸索和優(yōu)化。

    圖5 融合蛋白與抗體重組細(xì)胞半固體陽(yáng)性克隆數(shù)及熒光強(qiáng)度對(duì)比

    本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件,對(duì)融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞進(jìn)行了簡(jiǎn)單的摸索優(yōu)化,主要從電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量及細(xì)胞用量三方面入手,通過對(duì)比轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活率、密度及蛋白表達(dá)量的差異,最終確定細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)條件。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染相同的CHO-S細(xì)胞,融合蛋白分子和抗體分子的最佳轉(zhuǎn)染條件均不同,且抗體分子的蛋白表達(dá)效果略優(yōu)于融合蛋白分子。

    利用摸索好的最佳轉(zhuǎn)染條件,對(duì)CHO-S細(xì)胞電轉(zhuǎn)后進(jìn)行半固體接種,利用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix對(duì)轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒,這也為以后抗體或融合蛋白分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,獲得最優(yōu)的蛋白表達(dá)提供了一定的數(shù)據(jù)支持,也提示對(duì)于其他類型的細(xì)胞,或者其他重組質(zhì)粒,同樣需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行摸索,進(jìn)而得到最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果。

    4 結(jié)論

    融合蛋白重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為:電轉(zhuǎn)程序U-030,質(zhì)粒用量為20 μg/孔,細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔;抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為:電轉(zhuǎn)程序U-024,質(zhì)粒用量為15 μg/孔,細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,且抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    猜你喜歡
    質(zhì)粒用量條件
    2021年日本鈦加工材在各個(gè)領(lǐng)域用量統(tǒng)計(jì)
    排除多余的條件
    選擇合適的條件
    大豆種植意向增加16.4%化肥用量或?qū)p少
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    Side force controlon slender body by self-excited oscillation flag
    為什么夏天的雨最多
    農(nóng)戶如何稱取和配制小用量固體農(nóng)藥
    人間(2015年11期)2016-01-09 13:12:58
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一区二区三区免费毛片| 一区二区三区四区激情视频 | 此物有八面人人有两片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费看a级黄色片| 亚洲精品日韩av片在线观看| av免费在线看不卡| 热99在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本欧美国产在线视频| 国产探花在线观看一区二区| 一级黄色大片毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 69av精品久久久久久| 最新在线观看一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 成人欧美大片| 成人综合一区亚洲| 亚洲第一电影网av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲成av人片在线播放无| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一级黄色大片毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品成人久久久久久| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 男女那种视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区激情短视频| 简卡轻食公司| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩欧美精品v在线| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜激情福利司机影院| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲无线在线观看| 女人被狂操c到高潮| 尾随美女入室| 日本五十路高清| or卡值多少钱| 国产精品久久久久久久久免| 网址你懂的国产日韩在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩欧美精品免费久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久大精品| 久久人人爽人人片av| 国产精品不卡视频一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲最大成人av| 在线免费观看不下载黄p国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色在线成人网| 男女之事视频高清在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 91久久精品电影网| 国产av不卡久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线播放无遮挡| 午夜影院日韩av| 国产精品女同一区二区软件| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美zozozo另类| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人freesex在线 | 久久精品夜色国产| 国产探花极品一区二区| 久久这里只有精品中国| 国产片特级美女逼逼视频| 精品久久久噜噜| 三级国产精品欧美在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费看av在线观看网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国内揄拍国产精品人妻在线| 好男人在线观看高清免费视频| 国产高清三级在线| 久久热精品热| 真实男女啪啪啪动态图| 看十八女毛片水多多多| 丰满的人妻完整版| 国产成人影院久久av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 不卡一级毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精华一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av在线天堂中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲av免费在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 99精品在免费线老司机午夜| 国产三级在线视频| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美潮喷喷水| 午夜福利18| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美潮喷喷水| 国产不卡一卡二| 日韩高清综合在线| 在线播放无遮挡| 亚洲精品日韩av片在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美日韩乱码在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产高清不卡午夜福利| 国产av不卡久久| 秋霞在线观看毛片| 三级经典国产精品| 亚洲无线在线观看| 色av中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美中文日本在线观看视频| 99久久九九国产精品国产免费| 精品一区二区免费观看| 久久久色成人| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 精品人妻熟女av久视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 在线观看一区二区三区| 性色avwww在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜福利在线在线| 久久久久九九精品影院| 国产午夜精品论理片| 黄片wwwwww| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩欧美三级三区| 91精品国产九色| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久伊人网av| 最后的刺客免费高清国语| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费在线观看影片大全网站| 天美传媒精品一区二区| 中文在线观看免费www的网站| 身体一侧抽搐| 天堂动漫精品| 99久国产av精品| 日韩精品中文字幕看吧| 色哟哟·www| 久久久国产成人精品二区| 国产老妇女一区| 床上黄色一级片| 桃色一区二区三区在线观看| 久久精品91蜜桃| 乱人视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 午夜福利18| 日韩欧美三级三区| 日韩欧美 国产精品| 国产成人91sexporn| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99久久精品国产国产毛片| 天堂网av新在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 深夜a级毛片| 久久久久久久午夜电影| 久久久久久伊人网av| 男女之事视频高清在线观看| 日本三级黄在线观看| 成年版毛片免费区| 日韩av不卡免费在线播放| 精品午夜福利在线看| 国产成人aa在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产高清激情床上av| av专区在线播放| 免费看光身美女| 色在线成人网| 亚洲va在线va天堂va国产| 22中文网久久字幕| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线看三级毛片| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品一区av在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| av黄色大香蕉| 亚洲精品在线观看二区| 最后的刺客免费高清国语| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜a级毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 免费av观看视频| 亚洲av免费在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品国产自在天天线| 日韩一本色道免费dvd| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美激情国产日韩精品一区| a级一级毛片免费在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲18禁久久av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 长腿黑丝高跟| 床上黄色一级片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 97在线视频观看| av国产免费在线观看| 国产精品国产高清国产av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久99热6这里只有精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一级av片app| 有码 亚洲区| 一进一出好大好爽视频| 熟女电影av网| 插逼视频在线观看| 不卡一级毛片| 欧美bdsm另类| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产视频内射| 中文字幕av在线有码专区| 在线a可以看的网站| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲七黄色美女视频| 欧美3d第一页| av黄色大香蕉| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 中文字幕免费在线视频6| av女优亚洲男人天堂| 亚洲高清免费不卡视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩成人伦理影院| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲美女视频黄频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 床上黄色一级片| 日韩亚洲欧美综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品欧美国产一区二区三| 丝袜喷水一区| 精品熟女少妇av免费看| 免费电影在线观看免费观看| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 干丝袜人妻中文字幕| 丝袜喷水一区| 国产精品久久久久久久电影| 成人国产麻豆网| a级毛片a级免费在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 51国产日韩欧美| 亚洲中文日韩欧美视频| 深夜a级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产午夜精品论理片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 最好的美女福利视频网| 一级黄色大片毛片| h日本视频在线播放| 日韩欧美 国产精品| 国产三级中文精品| 久久久久久九九精品二区国产| 在线观看av片永久免费下载| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本成人三级电影网站| 日韩欧美 国产精品| 亚洲自拍偷在线| 波多野结衣高清无吗| 亚洲自拍偷在线| 国产男人的电影天堂91| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一级毛片我不卡| 99热6这里只有精品| 如何舔出高潮| 一级毛片我不卡| 一本一本综合久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品久久久久久av不卡| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产中年淑女户外野战色| 日韩国内少妇激情av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲图色成人| 少妇高潮的动态图| 在线免费观看的www视频| 好男人在线观看高清免费视频| 在线国产一区二区在线| 精品人妻视频免费看| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本色播在线视频| 国产成人影院久久av| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久国产成人精品二区| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品在线观看二区| 成人特级av手机在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久久久中文| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品久久久久久久电影| 岛国在线免费视频观看| 国产精品电影一区二区三区| 最好的美女福利视频网| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黑人高潮一二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 18禁在线播放成人免费| 久久久a久久爽久久v久久| 国产av在哪里看| 欧美色视频一区免费| 在线a可以看的网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 俺也久久电影网| 亚洲丝袜综合中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男女视频在线观看网站免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av.av天堂| 日日干狠狠操夜夜爽| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品亚洲美女久久久| 中国美女看黄片| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇的逼好多水| 天堂影院成人在线观看| 免费av毛片视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品,欧美在线| 中文在线观看免费www的网站| 成人国产麻豆网| 晚上一个人看的免费电影| 久久国产乱子免费精品| 能在线免费观看的黄片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美在线一区亚洲| 99热这里只有是精品50| 淫妇啪啪啪对白视频| 日日啪夜夜撸| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲成人av在线免费| 国产精品久久久久久av不卡| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一进一出抽搐gif免费好疼| 69人妻影院| 在线播放无遮挡| 国产一区二区激情短视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久人人精品亚洲av| 精品无人区乱码1区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本爱情动作片www.在线观看 | 成人综合一区亚洲| 一a级毛片在线观看| 1024手机看黄色片| 国产免费男女视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大香蕉久久网| 91久久精品国产一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99热精品在线国产| 婷婷色综合大香蕉| 久久久色成人| 亚洲专区国产一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品国产av成人精品 | 久久精品夜色国产| 色在线成人网| 校园春色视频在线观看| 黑人高潮一二区| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲无线在线观看| 亚洲无线观看免费| 色播亚洲综合网| 99视频精品全部免费 在线| 久久国内精品自在自线图片| 日韩精品青青久久久久久| 性欧美人与动物交配| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 中文字幕免费在线视频6| 丰满的人妻完整版| 免费观看精品视频网站| 亚洲最大成人av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线观看午夜福利视频| 我的老师免费观看完整版| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲成av人片在线播放无| av在线播放精品| av天堂中文字幕网| 好男人在线观看高清免费视频| 波多野结衣高清无吗| 如何舔出高潮| 亚洲av美国av| 欧美日本视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品一区www在线观看| 最好的美女福利视频网| 日本在线视频免费播放| 精品午夜福利在线看| 欧美高清成人免费视频www| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 在线免费十八禁| 日日啪夜夜撸| 日本三级黄在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 高清午夜精品一区二区三区 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日本免费a在线| h日本视频在线播放| 久久久色成人| 日韩欧美精品v在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 91狼人影院| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产综合懂色| 中国国产av一级| 看免费成人av毛片| 美女cb高潮喷水在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产久久久一区二区三区| 天堂动漫精品| 国产精品亚洲美女久久久| 97热精品久久久久久| 国产高潮美女av| 国产69精品久久久久777片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97在线视频观看| 黄色一级大片看看| 一本一本综合久久| 国产 一区精品| av黄色大香蕉| 舔av片在线| 看十八女毛片水多多多| 精品一区二区三区视频在线| 无遮挡黄片免费观看| 午夜久久久久精精品| or卡值多少钱| 女同久久另类99精品国产91| 午夜激情福利司机影院| 久久久成人免费电影| 国产精品电影一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美3d第一页| 国产一区亚洲一区在线观看| av在线亚洲专区| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 男人狂女人下面高潮的视频| 97超视频在线观看视频| 少妇的逼水好多| 69av精品久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久性生活片| 搡老岳熟女国产| 如何舔出高潮| 亚洲久久久久久中文字幕| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一区福利在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美国产日韩亚洲一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| eeuss影院久久| 日本在线视频免费播放| 天堂动漫精品| 久久久久久久久中文| 日本爱情动作片www.在线观看 | 午夜免费激情av| 高清午夜精品一区二区三区 | 久久草成人影院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 天堂影院成人在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产成人freesex在线 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久国产成人免费| 午夜福利高清视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品无大码| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av.av天堂| av专区在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲最大成人中文| 亚洲五月天丁香| 国产精品一区二区性色av| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲av美国av| 国产精品人妻久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 熟女电影av网| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲自拍偷在线| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲91精品色在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| av在线播放精品| 三级经典国产精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久6这里有精品| 午夜视频国产福利| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品久久久久久久末码| 熟女电影av网| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久午夜欧美精品| 精品日产1卡2卡| 男女下面进入的视频免费午夜| 天堂影院成人在线观看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久6这里有精品| 精品一区二区三区人妻视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲内射少妇av| 91狼人影院| 性插视频无遮挡在线免费观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 干丝袜人妻中文字幕| 精品一区二区免费观看| 99热精品在线国产| 日本爱情动作片www.在线观看 | 在线观看午夜福利视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久草成人影院| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 91久久精品国产一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕|