• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    融合蛋白基因與抗體基因電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的條件摸索優(yōu)化

    2019-05-09 06:57:44鄧曉芬楊曉佳易天紅馮英柯瀟賴維莉
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒用量條件

    鄧曉芬 楊曉佳 易天紅 馮英 柯瀟 賴維莉

    (成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品技術(shù)中心,成都 610036)

    近年來,全球藥物研發(fā)的重心正在從小分子化藥向生物大分子藥物轉(zhuǎn)移,比如抗體、疫苗、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、凝血因子和酶等,其中大部分為蛋白類藥物。由于多數(shù)蛋白類藥物分子量較小,半衰期短,為了延長(zhǎng)藥物的半衰期,蛋白融合技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1]。融合蛋白藥物是利用基因工程技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子與其他天然蛋白融合而產(chǎn)生的新型蛋白類藥物。與傳統(tǒng)的蛋白類藥物相比,融合蛋白藥物具有雙功能性[2],既提高了功能蛋白的穩(wěn)定性,延長(zhǎng)在體內(nèi)的代謝時(shí)間,又融合多個(gè)功能片段,形成高效靶向藥物。

    繼重組蛋白藥物之后,重組抗體藥物引領(lǐng)了第2次生物醫(yī)藥產(chǎn)品浪潮,是今后若干年新藥研發(fā)的主要方向[3]。重組抗體是指利用重組DNA技術(shù)或是基因突變的方法改造某種抗體基因的編碼序列,使之產(chǎn)生出自然界中原本不存在的抗體蛋白分子[4]。重組抗體類藥物從組成上分為兩類,一類是抗體本身,而另一類是由抗體本身與治療藥物(如放射性核素,毒素等)結(jié)合構(gòu)成。

    隨著生物藥物的發(fā)展,各種重組蛋白表達(dá)平臺(tái)也在發(fā)展,其中CHO細(xì)胞是表達(dá)重組蛋白(特別是融合蛋白和基因工程抗體)最常用的宿主之一[5-6],而重組蛋白基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá),最關(guān)鍵的步驟便是基因的轉(zhuǎn)染。目前常用的轉(zhuǎn)染方法主要有電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法等[7]。電轉(zhuǎn)染法相比其他轉(zhuǎn)染技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn),電轉(zhuǎn)染幾乎適用于所有細(xì)胞,但是不同的電轉(zhuǎn)染條件,會(huì)導(dǎo)致外源基因的轉(zhuǎn)染效率不同,即便在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)染相同細(xì)胞,不同的外源基因,轉(zhuǎn)染效率也會(huì)有所差別。本研究旨在摸索編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)染條件,并對(duì)比在最優(yōu)電轉(zhuǎn)條件下兩分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果,為后續(xù)電轉(zhuǎn)染重組融合蛋白和重組抗體分子提供一定的數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體融合蛋白表達(dá)載體pCMVi-VEGFR(由VEGFR1中的免疫球蛋白樣區(qū)域2和VEGFR2中的免疫球蛋白樣區(qū)域3,與人免疫球蛋白 Fc片段經(jīng)過融合而成),抗腫瘤壞死因子-α抗體表達(dá)載體pCMVi-TNF-α由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司構(gòu)建并保存。CHO-S細(xì)胞,購(gòu)自美國(guó)Life TechnologyTM公司。

    1.1.2 主要試劑及儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司,限制性內(nèi)切酶FspⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司,細(xì)胞培養(yǎng)基CD FortiCHO、Anticlumping agent、L-Glutamine均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,電轉(zhuǎn)儀Amaxa Nucleofector-II及試劑盒Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V購(gòu)自瑞士Lonza公司,紫外分光光度計(jì)Nanovue購(gòu)自美國(guó)GE公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Vi-cell購(gòu)自美國(guó)Beckman公司,Octet Qke Refurb檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Pall公司,CloneMedia-CHO、高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司,CO2培養(yǎng)箱Forma371購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司,細(xì)胞培養(yǎng)搖床ISF1-X購(gòu)自瑞士科耐公司。

    1.2 方法

    1.2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及線性化 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒菌種擴(kuò)大培養(yǎng),按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說明書的方法提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒的線性化,37℃過夜酶切后回收質(zhì)粒,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的線性化程度,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒DNA濃度后于-20℃保存待用。

    1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞用125 mL搖瓶,于120 r/min,36.5℃,5% CO2搖床培養(yǎng),每2-3 d進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以2×105vc/mL傳代,培養(yǎng)體積為30 mL,細(xì)胞傳代培養(yǎng)基配制:1 L CD FortiCHO培養(yǎng)基加入40 mL L-Glutamin 和 10 mL Anti-clumping agent,4℃保存,使用前室溫預(yù)熱。

    1.2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)條件的摸索 將線性化的重組質(zhì)粒進(jìn)行以下電轉(zhuǎn)染條件的摸索:電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量,具體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,首先在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,質(zhì)粒用量為10 μg/孔的前提下,摸索并確定最佳的電轉(zhuǎn)染程序(U-023、U-024、U-030),接著利用最佳的電轉(zhuǎn)染程序,在細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔的前提下,摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的質(zhì)粒用量(5、10、15、20 μg/孔),最后在最佳的電轉(zhuǎn)染程序和最佳的質(zhì)粒用量前提下,摸索并確定電轉(zhuǎn)最佳的細(xì)胞用量(1×107、1.5×107、2×107個(gè)/孔)。電轉(zhuǎn)染前,6孔板中各加入2.5 mL細(xì)胞傳代培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱;取CHO-S細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算使用的細(xì)胞體積;電轉(zhuǎn)染按Amaxa Cell line Nucleofector kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行;電轉(zhuǎn)染后,6孔板置于36.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),48 h后取0.5 mL細(xì)胞液檢測(cè)細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度,另取0.5 mL細(xì)胞液1000 r/min離心5 min,上清用Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)量,綜合細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)量判斷最佳電轉(zhuǎn)染條件,并最終對(duì)比融合蛋白與抗體表達(dá)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效果。

    1.2.4 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行轉(zhuǎn)染后重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到最佳密度5000 cells/mL;已融化的半固體培養(yǎng)基CloneMedia中加入其它成分,配成100 mL體積:90 mL CloneMedia+7 mL水+1 mL CloneDetect+2 mL Clone XL Reagent;將稀釋好的細(xì)胞液加入到配好的CloneMedia中,混勻后接種6孔板,2 mL/孔,37℃,5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后,觀察每個(gè)孔長(zhǎng)出的克隆數(shù),間接判斷細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

    表 1 電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2 結(jié)果

    2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒提取及線性化結(jié)果

    質(zhì)粒按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒方法提取,得到的質(zhì)粒濃度和純度均較高,見表2,用限制性內(nèi)切酶FspⅠ酶切后,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的線性化程度,見圖1,結(jié)果顯示質(zhì)粒線性化成功,可用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

    2.2 電轉(zhuǎn)染條件摸索試驗(yàn)結(jié)果

    將編碼融合蛋白和抗體的重組質(zhì)粒分子線性化后,轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,分別對(duì)兩種分子的電轉(zhuǎn)程序、質(zhì)粒用量和細(xì)胞用量進(jìn)行摸索。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其活率、密度,Octet Qke Refurb檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)量,通過對(duì)比細(xì)胞的狀態(tài)及蛋白表達(dá)量來確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖2。

    表2 重組表達(dá)質(zhì)粒濃度及純度

    圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化程度

    采用不同的電轉(zhuǎn)染程序(U-023、U-024、U-030)電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞,48 h后檢測(cè)細(xì)胞的活率(2-A)、細(xì)胞的密度(2-B)及細(xì)胞的蛋白表達(dá)量(2-C),結(jié)果發(fā)現(xiàn)U-030程序下細(xì)胞的密度雖然最低,但與其他電轉(zhuǎn)程序下的細(xì)胞密度相比,差異并不是特別明顯,且該細(xì)胞的蛋白表達(dá)量最高,因此確定最佳電轉(zhuǎn)染程序?yàn)閁-030;同理對(duì)電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的用量進(jìn)行摸索(2-D-F),確定最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔;對(duì)電轉(zhuǎn)染細(xì)胞的用量進(jìn)行摸索(2-G-I),確定最佳的細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-030,最佳質(zhì)粒用量為20 μg/孔,最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔??贵w重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索結(jié)果見圖3,其中包括對(duì)電轉(zhuǎn)程序的摸索結(jié)果(3-A-C)、質(zhì)粒用量的摸索結(jié)果(3-D-F)及細(xì)胞用量的摸索結(jié)果(3-G-I),最終確定該分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)程序?yàn)閁-024,最佳質(zhì)粒用量為15 μg/孔,最佳細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,兩分子的最佳轉(zhuǎn)染條件匯總見表3。

    表3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒的最佳電轉(zhuǎn)條件匯總

    圖2 融合蛋白重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.3 融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

    根據(jù)電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果,兩個(gè)重組質(zhì)粒均采用最佳條件電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,48 h后對(duì)細(xì)胞的活率、細(xì)胞的密度及蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖4。電轉(zhuǎn)后兩者的細(xì)胞活率(4-A)差異不大,抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度稍高于融合蛋白重組質(zhì)粒(4-B),且細(xì)胞的蛋白表達(dá)量也更高(4-C),證明抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果略優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    2.4 半固體培養(yǎng)間接檢測(cè)重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

    將采用最佳條件電轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞48 h后進(jìn)行半固體培養(yǎng)基接種,培養(yǎng)一段時(shí)間后采用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix進(jìn)行熒光成像,檢測(cè)兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的陽(yáng)性克隆數(shù)。結(jié)果如圖5,表達(dá)抗體的重組細(xì)胞形成的陽(yáng)性克隆個(gè)數(shù)多于融合蛋白重組細(xì)胞(圖5-A),且根據(jù)平均外部熒光強(qiáng)度判斷,抗體重組細(xì)胞陽(yáng)性克隆的熒光強(qiáng)度高于融合蛋白重組細(xì)胞(圖5-B、5-C),與2.3的結(jié)果趨勢(shì)一致,再一次證明了抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    圖 3 抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖4 融合蛋白重組質(zhì)粒與抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果對(duì)比

    3 討論

    目的基因能否進(jìn)行表達(dá),取決于表達(dá)質(zhì)粒能否成功轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)染作為重組生產(chǎn)用細(xì)胞株篩選的第一步,也是最重要的一步。目前常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要有物理方法、化學(xué)方法及生物方法[8],電轉(zhuǎn)染作為物理轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用非常廣泛,幾乎適用于所有細(xì)胞類型。但是不同的細(xì)胞系有不同的最佳轉(zhuǎn)染條件,即使是相同的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染入不同的外源基因,也會(huì)有不同的最佳條件,況且不同的實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染效率也有所不同[9],因此需對(duì)不同的基因,細(xì)胞類型,用量,轉(zhuǎn)染條件等因素進(jìn)行摸索和優(yōu)化。

    圖5 融合蛋白與抗體重組細(xì)胞半固體陽(yáng)性克隆數(shù)及熒光強(qiáng)度對(duì)比

    本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件,對(duì)融合蛋白重組質(zhì)粒和抗體重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞進(jìn)行了簡(jiǎn)單的摸索優(yōu)化,主要從電轉(zhuǎn)染程序、質(zhì)粒用量及細(xì)胞用量三方面入手,通過對(duì)比轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活率、密度及蛋白表達(dá)量的差異,最終確定細(xì)胞的最佳電轉(zhuǎn)條件。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染相同的CHO-S細(xì)胞,融合蛋白分子和抗體分子的最佳轉(zhuǎn)染條件均不同,且抗體分子的蛋白表達(dá)效果略優(yōu)于融合蛋白分子。

    利用摸索好的最佳轉(zhuǎn)染條件,對(duì)CHO-S細(xì)胞電轉(zhuǎn)后進(jìn)行半固體接種,利用高通量細(xì)胞篩選儀Clone Pix對(duì)轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒,這也為以后抗體或融合蛋白分子轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞,獲得最優(yōu)的蛋白表達(dá)提供了一定的數(shù)據(jù)支持,也提示對(duì)于其他類型的細(xì)胞,或者其他重組質(zhì)粒,同樣需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行摸索,進(jìn)而得到最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果。

    4 結(jié)論

    融合蛋白重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為:電轉(zhuǎn)程序U-030,質(zhì)粒用量為20 μg/孔,細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔;抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的最佳條件為:電轉(zhuǎn)程序U-024,質(zhì)粒用量為15 μg/孔,細(xì)胞用量為1×107個(gè)/孔,且抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞的效果優(yōu)于融合蛋白重組質(zhì)粒。

    猜你喜歡
    質(zhì)粒用量條件
    2021年日本鈦加工材在各個(gè)領(lǐng)域用量統(tǒng)計(jì)
    排除多余的條件
    選擇合適的條件
    大豆種植意向增加16.4%化肥用量或?qū)p少
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    Side force controlon slender body by self-excited oscillation flag
    為什么夏天的雨最多
    農(nóng)戶如何稱取和配制小用量固體農(nóng)藥
    人間(2015年11期)2016-01-09 13:12:58
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    成年人午夜在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av有码第一页| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色5月婷婷丁香| 赤兔流量卡办理| h视频一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | a 毛片基地| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝袜在线中文字幕| 久久这里有精品视频免费| 91精品三级在线观看| 中文天堂在线官网| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲图色成人| 大陆偷拍与自拍| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 日日撸夜夜添| 一本大道久久a久久精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 90打野战视频偷拍视频| 99香蕉大伊视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 中国美白少妇内射xxxbb| 伊人亚洲综合成人网| 我的女老师完整版在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 韩国精品一区二区三区 | 黄色毛片三级朝国网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲成人av在线免费| 99热国产这里只有精品6| 色视频在线一区二区三区| 三级国产精品片| 亚洲国产看品久久| 亚洲av国产av综合av卡| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲人与动物交配视频| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲av中文av极速乱| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久国内精品自在自线图片| 男人添女人高潮全过程视频| 永久网站在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲综合精品二区| 精品一区二区三卡| 欧美精品一区二区大全| √禁漫天堂资源中文www| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品一区蜜桃| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜激情av网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 男女高潮啪啪啪动态图| 婷婷成人精品国产| 波野结衣二区三区在线| 成人国产av品久久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲精品av麻豆狂野| 黄色 视频免费看| 国产在线视频一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 咕卡用的链子| 成年动漫av网址| 成人毛片60女人毛片免费| 麻豆乱淫一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品一国产av| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕免费在线视频6| 少妇高潮的动态图| 大码成人一级视频| 在线 av 中文字幕| 97超碰精品成人国产| 超色免费av| 制服人妻中文乱码| 18禁观看日本| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久网色| 欧美人与善性xxx| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人免费无遮挡视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲经典国产精华液单| 午夜激情久久久久久久| 在线观看www视频免费| 亚洲久久久国产精品| 观看av在线不卡| av国产精品久久久久影院| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久久久久久久免费av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男人添女人高潮全过程视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产片内射在线| 国产精品一二三区在线看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最新中文字幕久久久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品,欧美精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 如何舔出高潮| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 男女边摸边吃奶| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级毛片 在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av国产av综合av卡| 大片免费播放器 马上看| 丝袜喷水一区| 大香蕉久久成人网| 国产在视频线精品| av视频免费观看在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久人人爽人人片av| 捣出白浆h1v1| 亚洲av福利一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲国产av影院在线观看| 女性被躁到高潮视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人精品无人区| 在线观看国产h片| 午夜精品国产一区二区电影| 色网站视频免费| 午夜激情久久久久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 免费观看在线日韩| 一级毛片电影观看| 高清在线视频一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看 | 免费av不卡在线播放| 在线观看三级黄色| 亚洲国产成人一精品久久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 视频中文字幕在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 香蕉国产在线看| 精品国产国语对白av| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品成人在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成年女人在线观看亚洲视频| 中文欧美无线码| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美97在线视频| 一区二区三区精品91| 毛片一级片免费看久久久久| 国产免费又黄又爽又色| 成人国产麻豆网| 精品一区二区三区视频在线| 人妻一区二区av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲国产精品成人久久小说| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲精品第二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 2018国产大陆天天弄谢| 老熟女久久久| 最新的欧美精品一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品一二三| 少妇人妻久久综合中文| 国产69精品久久久久777片| 老司机影院毛片| 欧美国产精品一级二级三级| 18禁观看日本| 男女边摸边吃奶| 男男h啪啪无遮挡| 成人综合一区亚洲| 精品一区二区免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久精品精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产一区二区久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 人妻系列 视频| 欧美最新免费一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 99久久人妻综合| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 最黄视频免费看| 99久国产av精品国产电影| 欧美激情 高清一区二区三区| av免费在线看不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产福利在线免费观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 成人国产麻豆网| 少妇人妻精品综合一区二区| 岛国毛片在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一个人免费看片子| 国产国语露脸激情在线看| 少妇人妻精品综合一区二区| 99国产综合亚洲精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费观看a级毛片全部| 精品一区二区三区视频在线| 精品酒店卫生间| 国产精品免费大片| 在线观看人妻少妇| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黑丝袜美女国产一区| 精品第一国产精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品久久久久久| av国产精品久久久久影院| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产 一区精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产免费现黄频在线看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产淫语在线视频| 亚洲精品色激情综合| 欧美 日韩 精品 国产| a级毛片在线看网站| 午夜91福利影院| 亚洲久久久国产精品| 国产激情久久老熟女| 韩国精品一区二区三区 | 乱人伦中国视频| 欧美日韩成人在线一区二区| av不卡在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲三级黄色毛片| 桃花免费在线播放| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美另类一区| 亚洲第一av免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美 日韩 精品 国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 中文字幕av电影在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文字幕制服av| av在线观看视频网站免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品在线电影| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 少妇人妻精品综合一区二区| 九草在线视频观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 18+在线观看网站| 少妇的丰满在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品一国产av| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜日本视频在线| 亚洲精品第二区| 成人毛片60女人毛片免费| 精品国产国语对白av| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕av电影在线播放| 欧美+日韩+精品| 一级毛片电影观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 日本91视频免费播放| 日韩伦理黄色片| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人手机av| 秋霞在线观看毛片| 18在线观看网站| 欧美日韩av久久| 制服丝袜香蕉在线| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久午夜福利片| 岛国毛片在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久久久久久成人| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 高清av免费在线| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲综合色惰| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 一区在线观看完整版| 性色av一级| 国产精品国产三级专区第一集| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av卡一久久| 在线天堂中文资源库| 免费大片18禁| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产成人a∨麻豆精品| 不卡视频在线观看欧美| av国产精品久久久久影院| 欧美人与善性xxx| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产日韩欧美亚洲二区| 日日撸夜夜添| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费在线观看黄色视频的| 香蕉精品网在线| 午夜av观看不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费日韩欧美在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 国产 精品1| 一级片免费观看大全| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲经典国产精华液单| 午夜老司机福利剧场| 波野结衣二区三区在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文字幕人妻丝袜制服| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本黄大片高清| 老司机影院成人| 永久网站在线| 水蜜桃什么品种好| av在线观看视频网站免费| 国产精品一二三区在线看| 一区二区三区精品91| 国产69精品久久久久777片| 国产一区二区三区av在线| 欧美3d第一页| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久久国产电影| 国产成人91sexporn| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 免费看不卡的av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 国产日韩欧美视频二区| 街头女战士在线观看网站| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品,欧美精品| 蜜桃国产av成人99| 亚洲av成人精品一二三区| 十八禁高潮呻吟视频| 成人国语在线视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 精品少妇黑人巨大在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 大香蕉久久网| 成人无遮挡网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 熟女人妻精品中文字幕| 街头女战士在线观看网站| 国产精品蜜桃在线观看| 日本wwww免费看| 十八禁高潮呻吟视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久婷婷青草| 久久影院123| 18+在线观看网站| 色视频在线一区二区三区| 九草在线视频观看| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久精品夜色国产| 午夜av观看不卡| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 精品视频人人做人人爽| 久久热在线av| 成人免费观看视频高清| 日本欧美国产在线视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲,一卡二卡三卡| 老司机影院毛片| 99久国产av精品国产电影| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产69精品久久久久777片| 婷婷色综合大香蕉| 91成人精品电影| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费看不卡的av| 天堂8中文在线网| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲综合精品二区| 国产精品 国内视频| 国产日韩欧美视频二区| 黄片无遮挡物在线观看| 18禁观看日本| 在线观看三级黄色| 国产精品国产av在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 90打野战视频偷拍视频| 精品一区二区三区视频在线| 91国产中文字幕| 久久人人97超碰香蕉20202| 成人国产av品久久久| a 毛片基地| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 秋霞伦理黄片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产 精品1| 欧美日韩视频精品一区| 韩国精品一区二区三区 | 亚洲性久久影院| 亚洲精品av麻豆狂野| 全区人妻精品视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品人人爽人人爽视色| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 日日撸夜夜添| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品熟女少妇av免费看| 少妇熟女欧美另类| 久久这里只有精品19| 免费少妇av软件| 成人漫画全彩无遮挡| 国产成人精品在线电影| 欧美日韩av久久| 日本色播在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 97在线视频观看| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美人与性动交α欧美软件 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久久久精品人妻al黑| 欧美人与性动交α欧美软件 | 韩国精品一区二区三区 | 国产在线视频一区二区| 大香蕉97超碰在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 日日啪夜夜爽| 欧美精品av麻豆av| 女性生殖器流出的白浆| 人妻少妇偷人精品九色| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美女中出高潮动态图| 观看美女的网站| 精品国产露脸久久av麻豆| 免费黄色在线免费观看| 国产麻豆69| 午夜视频国产福利| 嫩草影院入口| 1024视频免费在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| √禁漫天堂资源中文www| 黄色配什么色好看| 在现免费观看毛片| 免费观看a级毛片全部| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 成人亚洲欧美一区二区av| 97精品久久久久久久久久精品| 人人妻人人澡人人看| 在线观看免费视频网站a站| av国产精品久久久久影院| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲性久久影院| 婷婷色综合www| 国产精品偷伦视频观看了| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 全区人妻精品视频| 久久精品久久久久久久性| 我的女老师完整版在线观看| 国产毛片在线视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美精品一区二区免费开放| 国产色爽女视频免费观看| 黄片播放在线免费| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| a级毛色黄片| 色吧在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 高清欧美精品videossex| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产成人精品一,二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久99一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品国产av在线观看| 午夜91福利影院| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产在线视频一区二区| a级毛片黄视频| 日韩中字成人| 免费人成在线观看视频色| 美女福利国产在线| freevideosex欧美| 国产色爽女视频免费观看| 天美传媒精品一区二区| 精品福利永久在线观看| 久久久久久人妻| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲综合色惰| 亚洲,欧美,日韩| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩精品有码人妻一区| 久久毛片免费看一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| 午夜av观看不卡| 精品一品国产午夜福利视频| 久久午夜福利片| 久久99蜜桃精品久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 观看美女的网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美精品av麻豆av| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品456在线播放app| 高清av免费在线| 老司机影院毛片| 亚洲av综合色区一区| 有码 亚洲区| 免费高清在线观看日韩| 亚洲成人一二三区av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲经典国产精华液单| 国产亚洲一区二区精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品一二三区在线看| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲av电影在线进入| 久久精品久久久久久久性| 一级片'在线观看视频| 国产高清不卡午夜福利|