一種簡化的油菜雜交F1種子的生產(chǎn)方法

楊光圣，辛強，董發(fā)明，洪登峰

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一種簡化的油菜雜交F1種子的生產(chǎn)方法

楊光圣，辛強，董發(fā)明，洪登峰

（華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢 430070）

安全有效的制種方法是油菜雜交種應(yīng)用的關(guān)鍵。通過回交轉(zhuǎn)育獲得抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和系，將其作為雜交種父本。父本因其具有自交不親和特性，自交不結(jié)實；因其具有抗（耐）磺酰脲類除草劑特性，在用磺酰脲類除草劑進行母本化學殺雄時，不受化學殺雄劑影響。因此，可以將父本與不育系或者化學殺雄的母本材料混合播種，實現(xiàn)雜交種父、母本的混播混收。通過本文提出的雜交制種方法，只要選育出兼有抗（耐）磺酰脲類除草劑和自交不親和特性的父本，即可進行雜交種的快速組配。該方法將父、母本混播混收，操作簡單，節(jié)約了勞動成本，提高了雜交種制種效率。

甘藍型油菜；雜交種；制種；化學殺雄；自交不親和

0 引言

油菜作為中國第四大農(nóng)作物、第二大冬季農(nóng)作物、第一大油料作物，在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著舉足輕重的地位。菜籽油作為國產(chǎn)食用植物油第一大來源，占中國油料作物產(chǎn)油量的57.2%[1]。近十年來，中國油菜單位面積產(chǎn)量獲得持續(xù)提升，主要得益于雜交油菜的大面積種植。目前，中國雜交油菜制種應(yīng)用的授粉控制系統(tǒng)包括波里馬細胞質(zhì)雄性不育三系或兩系、S45A和9012AB類型的核不育系統(tǒng)、化學殺雄及自交不親和等，這些系統(tǒng)在制 種過程中均需要將父、母本按一定行比分行播種，分開收割，不僅費時費工，而且存在出錯的風險，影響商品雜交種的純度。為了提高制種效率，降低雜交種子生產(chǎn)成本，增加雜交種純度，降低生產(chǎn)風險，筆者提出一種簡化的油菜雜交F1種子生產(chǎn)方法。

目前，國內(nèi)外研究中利用的油菜細胞質(zhì)雄性不育類型有10多種，生產(chǎn)上應(yīng)用比較廣泛的有蘿卜細胞質(zhì)雄性不育類型（CMS）[2-3]、波里馬細胞質(zhì)雄性不育類型（CMS）[4]等。其中，CMS被認為是國際上第一個具有實用價值的油菜雄性不育系，也是中國唯一在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的細胞質(zhì)不育類型。楊光圣等[5-7]1990年在CMS三系的基礎(chǔ)上選育出溫敏生態(tài)型細胞質(zhì)雄性不育兩用系，其在相對高溫條件下表現(xiàn)雄性不育，在相對低溫條件下表現(xiàn)雄性可育。該不育兩用系可能是通過細胞核內(nèi)的溫度敏感基因來調(diào)控線粒體基因的轉(zhuǎn)錄模式或RNA的加工來實現(xiàn)育性變化的[8]。該系統(tǒng)恢復基因編碼一個PPR蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平降低的積累量，從而恢復不育系育性[9]。目前，筆者利用該系統(tǒng)已選育出195A、206A、616A等多個品質(zhì)性狀、經(jīng)濟性狀和農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)優(yōu)良的生態(tài)型雄性不育兩用系，培育出華油雜10號等20多個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交油菜新品種。

目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的油菜細胞核不育主要有3種：（1）隱性細胞核不育，主要有雙隱性重疊基因控制的S45A[10]和2對隱性互作基因控制的9012A[11]；（2）顯性細胞核不育，如宜3A類型[12]；（3）人工創(chuàng)制的轉(zhuǎn)基因細胞核不育系統(tǒng)，如SeedLinkTM系統(tǒng)[13]。在中國生產(chǎn)上利用的主要是隱性細胞核不育系統(tǒng)，其中，由于S45A類型不育系在制種時，需要拔除母本行50%的可育株，極大地限制了它在生產(chǎn)上的應(yīng)用。9012A類型核不育系統(tǒng)因具有不育性穩(wěn)定徹底、恢復源廣、無負胞質(zhì)效應(yīng)、可通過引入臨保系產(chǎn)生100%不育群體等優(yōu)點，被認為是一個具有較大應(yīng)用潛力的授粉控制系統(tǒng)。后來，國內(nèi)科研人員對該不育系統(tǒng)的遺傳模式進行了修正[14-16]，并克隆了其育性控制基因，開發(fā)出多個可以應(yīng)用于育種的分子標記，解析了其雄性不育的機制[1-20]。通過該不育系統(tǒng)的三系配套已選育出多個雜交種，如安徽省農(nóng)業(yè)科學院選育的部分皖油和核優(yōu)系列組合、上海市農(nóng)業(yè)科學院選育的部分滬油雜系列組合、浙江省農(nóng)業(yè)科學院選育的浙油雜系列組合、華中農(nóng)業(yè)大學選育的華油雜系列組合等。

化學殺雄劑（也叫化學雜交劑）是一類可以誘導雄性不育的化學試劑。目前，油菜生產(chǎn)應(yīng)用中的殺雄劑主要包括氯代脂肪酸類、無機鹽類、激素類、甲基胂酸鹽類以及應(yīng)用最廣的磺酰脲類除草劑、氨基磺酸類藥物。因其在雜種優(yōu)勢利用時，具有親本選擇選配范圍廣、育種周期短等優(yōu)勢，并可用于解決細胞質(zhì)不育系存在微粉等問題，在作物雜種優(yōu)勢利用中獲得廣泛應(yīng)用。近十多年來，已審定和登記了一系列雜交油菜品種（如湘雜油1號、湘雜油6號、秦雜油19、華油雜68以及中國含油量第一個超過50%的秦雜油4號等）。近年來，磺酰脲類除草劑是在中國應(yīng)用最多最成功的化學殺雄劑，其化學殺雄的生物學機制已獲得較好的闡釋。葉面噴施的低劑量苯磺隆通過極性運輸在花藥中積累，特異性靶定乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthetase，AHAS），抑制支鏈氨基酸的合成，最終誘導花藥自體吞噬型細胞死亡，形成雄性不育[21-22]。

自交不親和是指植物雖然能產(chǎn)生正常功能的配子，但不能自花授粉或者授粉后不能結(jié)實的現(xiàn)象。蕓薹屬植物中自交不親和性由一個S位點調(diào)控，該位點包含2個復等位基因：一個柱頭特異表達的S位點受體激酶（S-locus receptor kinase，SRK）基因和一個位于花粉外壁的受體蛋白SP11（S-locus protein 11或稱為S-locus cysteine-rich，SCR）基因[23]。由于S位點的基因幾乎不發(fā)生重組，而作為一個遺傳單位進行傳遞，因此，將其稱為S單倍型（S haplotype）[24]。蕓薹屬作物中，白菜和甘藍以及人工合成的甘藍型油菜表現(xiàn)為自交不親和，生產(chǎn)上應(yīng)用的甘藍型油菜表現(xiàn)為自交親和。S1300是研究較多的一個甘藍型油菜自交不親和系，轉(zhuǎn)育自甘藍型油菜和白菜雜交育成的自交不親和系271[25]。研究發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜自交親和系的S單倍型在C基因組上是S單倍型，A基因組上S單倍型為和；S1300的自交不親和性由A基因組S單倍型控制，與白菜S單倍型同源，其對應(yīng)的恢復系和保持系S單倍型分別為A基因組的和[26-31]。雖然甘藍型油菜自交不親和以及自交親和形成機理還未獲得完全解析，但這些S位點基因的克隆和序列分析，為育種家提供了遺傳轉(zhuǎn)育優(yōu)良的分子標記，這將加快自交不親和在油菜雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用進程。

雖然上述雜種優(yōu)勢利用的方法在雜交種制種過程中獲得廣泛應(yīng)用，但父、母本均需按一定行比分開種植，分別收割，費時費力，同時存在父本混雜的風險。

本研究提出一種簡化油菜雜交種生產(chǎn)的方法，利用轉(zhuǎn)育的抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和系為父本，與各種類型不同來源的母本材料按一定比例混合，直接將母本和父本混播混收。該方法不僅操作簡單，而且能節(jié)約勞動成本和提高種子純度。

1 構(gòu)想

首先需要轉(zhuǎn)育獲得抗（耐）磺酰脲類除草劑（herbicide resistance，HR）、自交不親和（self- incompatibility，SI）的父本（恢復系或自交系品種），具體選育方法是通過回交轉(zhuǎn)育和分子標記輔助選擇的方法，將自交不親和基因和乙酰乳酸合成酶突變基因或或+聚合到生產(chǎn)油菜雜交種的父本中，將父本變成抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和系；同時采用同樣的方法將自交不親和保持基因BnS-7和乙酰乳酸合成酶基因或或+聚合到生產(chǎn)油菜雜交種的父本中，選育出抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和同核保持系。這樣，就可以用抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和系和抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和同核保持系繁殖出的F1實現(xiàn)雜交種父本的大規(guī)模繁殖。同時，還可以通過開花期噴施食鹽水的方法繁殖抗（耐）磺酰脲類除草劑的自交不親和系父本（圖1）。無論采用哪種方法，均可以在苗期噴施磺酰脲類除草劑（正常除草濃度）來殺死雜株，以提高繁殖父本的純度（圖1）。

本方法使用的母本材料可以不受雄性育性的限制，根據(jù)母本的來源，將母本分為3種類型：（1）類型1，生產(chǎn)上廣泛使用的全不育系，例如蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系、穩(wěn)定型CMS不育系、9012A類型的細胞核雄性不育系；（2）類型2，育性有分離或不穩(wěn)定的不育系統(tǒng)，例如育性不穩(wěn)定的CMS不育系，在傳統(tǒng)制種過程中需要拔除一半可育株的S45A系統(tǒng)不育系等；（3）類型3，常規(guī)自交系或常規(guī)品種，即在傳統(tǒng)制種中通過化學殺雄作為母本的自交系或常規(guī)品種。

在播種前，將母本（類型1、類型2或類型3）種子與其對應(yīng)的同時具有抗（耐）磺酰脲類除草劑和自交不親和特性的父本種子按一定比例（母本﹕父本=70%—90%﹕10%—30%）均勻混合。將混合的種子播種（人工撒播或條播、機械條播）于種子生產(chǎn)隔離區(qū)大田，苗期按常規(guī)方法進行田間去雜。對于類型1不育系材料，其不育性穩(wěn)定且徹底，因此，制種時只需將父、母本種子按比例混勻播種即可。由于父本具有自交不親和特性，因此不能正常自交結(jié)實，所以收獲時可以直接混收，不需父、母本分別收割或者收獲前砍掉父本（圖2-A）。對于類型2和類型3母本，由于其具有可育花粉，需要在現(xiàn)蕾初期噴施含苯磺隆的化學雜交劑，15—20 d后再噴一次同樣的化學雜交劑，進行化學殺雄，種子成熟時，將父、母本混收，獲得F1雜交種子（圖2-B和圖2-C）。對于類型1母本材料，為了降低因親本不純或田間自生苗對制種種子純度的影響，也可以參照上述方法，在田間噴施2次同樣的化學雜交劑，將雜株和自生苗殺雄（圖2-A）。

圖1 簡化油菜雜交種制種：父本轉(zhuǎn)育及繁殖示意圖

A：類型1母本，生產(chǎn)上廣泛使用的全不育系?？稍诂F(xiàn)蕾初期噴施含苯磺隆的化學誘導雄性不育劑，將雜株殺雄，提高制種純度。B：類型2母本，育性有分離或不穩(wěn)定的不育系統(tǒng)；C：類型3母本，常規(guī)自交系和常規(guī)品種

2 討論

2.1 本構(gòu)想產(chǎn)生的歷史背景與研究進展

油菜現(xiàn)有的雜種優(yōu)勢利用途徑都有自己的優(yōu)點和缺點。同時，無論哪條途徑，在生產(chǎn)F1雜交種時，需要將父、母本分開種植，分別收割。不僅費時費力，而且容易造成機械或人為混雜。因此，發(fā)掘一條更加簡便通用的途徑，簡化油菜雜交種子生產(chǎn)過程，降低種子生產(chǎn)成本，尤其是降低種子生產(chǎn)風險，一直是筆者思考的重要問題。2013年春節(jié)，筆者腦海突然產(chǎn)生此構(gòu)想。經(jīng)過4年多的努力，于2017年成功選育出7-5STR（圖3）等多個同時具有自交不親和和磺酰脲類除草劑抗性的波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復系。目前，正在將所有重要雜交油菜品種的父本轉(zhuǎn)育成同時具有自交不親和和磺酰脲類除草劑抗性的材料。且于2017年開始了小規(guī)模種子生產(chǎn)試驗，2018年已有7-5STR配制2個雜交油菜品種申報國家和湖北省區(qū)域試驗。

2.2 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本構(gòu)想雜交制種方法的優(yōu)點

（1）播種時，傳統(tǒng)雜交種子生產(chǎn)方法是將母本和父本按一定行比分開種植，人工育苗移栽一般是先栽母本，后栽父本。人工直播一般是先播母本再播父本。機械播種要將母本與父本分行播種。這樣不僅費工費時，而且常常出錯。本構(gòu)想將母本和父本混合種植，生產(chǎn)程序簡單，節(jié)約勞動成本，省錢又省力；同時還不易出錯。

（2）收獲時，傳統(tǒng)方法是將母本和父本分開收割，或提前將父本砍掉。提前砍父本，無疑會增加勞動力成本；將父母本分開收割，不僅會增加勞動力成本，而且常常會出錯，或人為混雜，導致父本混入母本中，影響種子純度。本構(gòu)想直接將母本和父本混收，操作簡單，不僅節(jié)約了勞動成本；同時由于父本具有自交不親和特性，不能正常結(jié)實，從根本上減少了將父本種子混入F1種子的風險，有利于提高種子純度。

7-5：波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復系；12eRS7-4：抗磺酰脲類除草劑突變體；SI華油雜95F2：自交不親和雜交品種華油雜95自交F2中的自交不親和株

（3）與傳統(tǒng)方法比較，由于本構(gòu)想中的父本具有自交不親和特性，它不能正常結(jié)實，開花期會延長，有利于給母本授粉，提高F1種子產(chǎn)量。不僅如此，對于父本開花期早或開花期短的雜交組合，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是將父本遲播或?qū)⒏副敬蜣贰＿t播父本往往生長勢弱、開花期變短，導致制種產(chǎn)量下降。將父本打薹，則會導致父本開花期縮短，比母本提前終花，母本后期開的花不能正常授粉結(jié)實，也會導致減產(chǎn)。

（4）傳統(tǒng)方法中，當利用波里馬細胞質(zhì)雄性不育系制種時，母本行去雜不徹底會導致雜株給不育系授粉，影響雜種純度；同時波里馬細胞質(zhì)雄性不育系育性易受溫度影響，不育系的育性不穩(wěn)定可能導致自交或兄妹交結(jié)實，影響雜種純度。本構(gòu)想可以通過噴施殺雄劑將母本行中的雜株和母本同時殺雄，消除了雜株給母本授粉和不育系自交或兄妹交的風險，有利于提高種子純度，降低生產(chǎn)風險。

（5）傳統(tǒng)方法中，化學殺雄制種時，給母本行噴施殺雄劑要避免噴到父本上，否則會將父本殺雄，減少父本花粉量，影響制種產(chǎn)量。而為了避免將殺雄劑噴到父本上，傳統(tǒng)方法要采用一定的隔離措施。本構(gòu)想由于父本帶有磺酰脲類除草劑抗性基因，噴施苯磺隆不會影響父本的雄性育性，不需要采取隔離措施。這樣不僅可以提高制種產(chǎn)量，而且還可以減少勞動力投入，提高制種效益。

（6）本構(gòu)想利用的自交不親和性在遺傳上是隱性的，不會影響其雜交F1的自交親和性。同時，由于隔離不嚴格或田間自生苗去雜不徹底，自交不親和父本接受其他材料花粉授粉受精所產(chǎn)生的后代也會表現(xiàn)自交親和。

2.3 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本構(gòu)想的不足

（1）由于要選育具有自交和親和特性和磺酰脲類除草劑抗性的父本，父本的選育程序比傳統(tǒng)方法復雜，且選育周期可能會長一些。為了彌補這一缺陷，可以將分子標記輔助育種和全基因組選擇應(yīng)用到父本的選育過程中。

（2）父本的繁殖純度及自交不親和性的穩(wěn)定性會影響雜交種的制種純度。要提高父本的繁殖純度，一是要嚴格按照親本繁殖程序進行父本的繁殖；二是可以在苗期通過噴施磺酰脲類除草劑殺死雜株。要保持父本自交不親和性的穩(wěn)定性，一是要選育自交不親和性穩(wěn)定的父本；二是要嚴格按照親本繁殖程序進行父本的繁殖，防止生物學混雜；三是建議采用DH系，減少剩余變異的影響；四是建議通過噴施食鹽水繁殖父本，不用保持系繁殖父本。

（3）自交不親和父本并不是完全自交不結(jié)實。不同的自交不親和父本自交結(jié)實能力可能不同，同一自交不親和父本在不同的制種環(huán)境下也可能會有不同程度的自交結(jié)實。目前，利用細胞核雄性不育系RG430A與父本7-5STR在人工大棚隔離放蜜蜂輔助授粉的條件下，父本自交結(jié)實所產(chǎn)生種子占整個種子的比列低于1%。

（4）對于父、母本開花期差異特別大，尤其是母本開花期特別早的雜交組合，應(yīng)用該方法進行雜交F1種子會受到一定限制。當遇到父、母本開花期差異較大的組合時，可以通過人工或機械打苔來使開花期相遇。

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A simplified production method of hybrid F1seeds in rapeseed

YANG GuangSheng, XIN Qiang, DONG FaMing, HONG DengFeng

(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

Safe and effective F1seed production method is the key to hybrid production in rapeseed. Father parent lines with tribenuron-methyl resistance (or tolerance) and self-incompatiblity can be developed by means of backcross breeding. In the F1hybrid seed production by using tribenuron-methyl as the male sterility induction agent, the father parent lines have no seedset by self-pollination because of their self-incompatibility, and are not affected by the chemical agent because of their tribenuron-methyl resistance (or tolerance). Therefore, the parental lines can be mixed sowing and the seeds can be mixed harvesting. Using the method we proposed, if the lines with tribenuron-methyl resistance (tolerance) and self-incompatiblity are already developed, hybrid breeding can be carried out immediately. It saves labor costs, improves seed production efficiency and increases seed purity because of the mixed sowing and mixed harvesting.

; hybrid; F1seed production; chemical inducing male sterility; self-incompatibility

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.004

2018-11-27；

2019-01-20

油菜雜種優(yōu)勢利用技術(shù)與強優(yōu)勢雜交種創(chuàng)制（2016YFD0101300）、油菜溫敏細胞質(zhì)雄性不育機理與應(yīng)用研究（2662017PY020）

楊光圣，Tel：027-87281713；E-mail：gsyang@mail.hzau.edu.cn

（責任編輯 李莉）