四個不結(jié)球白菜自交不親和S單元型分子鑒定

李霞等

摘要：利用已報道的SRK及SLG基因序列保守區(qū)設(shè)計的特異性引物，通過PCR 擴增和克隆測序，結(jié)合生物信息學分析方法對4份國外引進的不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）自交不親和材料的S單元型進行分子鑒定。結(jié)果表明，不親和材料A1包含的S位點基因序列與甘藍（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31的相似度為98%（E值是0）；不親和材料A2、A3包含ClassI類及ClassⅡ類2種S單元型，S位點處于雜合狀態(tài)。不親和材料A4包含的S位點基因序列與青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）單倍型BOI1 SRK蛋白基因具有98 %的序列相似度，序列覆蓋度達99%。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；自交不親和；S單元型；分子鑒定

中圖分類號：S634.3；Q321+.7；Q503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.030

Molecular Identification of S Haplotypes in Four Self-Incompatible Germplasm Resources of Brassica campestris ssp. chinensis

LI Xia，HU Zhen-hua，ZHOU Guo-lin，WANG Ai-hua

（Wuhan Vegetable Demonstration Center of Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 436400， China）

Abstract： Using the primers designed according to the conserved sequence of S locus kinase （SRK） gene and S locus glycoprotein （SLG） gene， by PCR amplification， combined with bio-informatics analysis the S haplotypes of 4 Brassica campestris ssp. chinensis Makino self-incompatibility material from overseas were identified. The results indicated that the A1 self-incompatible line showed 98% similarity with SLG-31 gene in B. oleracea L. var. capitata L.； and the A2， A3 self-incompatible line both contained two types of S haplotype from Class I and ClassⅡ， which showed that the S locus were at heterozygous state. The A4 self-incompatible line showed 98% similarity with BOI1 SRK gene in B. oleracea L. var. italica Plenck under 99% query coverage.

Key words： Brassica campestris ssp. chinensis Makino； self-incompatibility； S haplotype； molecular identification

白菜（Brassica campestris L.）屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica L.），原產(chǎn)于中國，栽培歷史悠久。其規(guī)模無論是面積還是產(chǎn)量，在蔬菜作物中均居首位。不結(jié)球白菜，又稱小白菜（B. campestris L. ssp. chinensis Makino），主要分布在長江流域的中、下游地區(qū)，其播種面積約占該地區(qū)蔬菜總面積的1/3。白菜為典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢顯著，利用自交不親和（Self-incompatibility）系制種是目前最常用的白菜雜交制種技術(shù)之一，其主要靠不同單倍型自交不親和系之間互配來獲得，因此對于育種工作者來說，獲得自交不親和系單倍型的快速準確鑒定至關(guān)重要。目前普遍采用花期交互授粉的方法進行鑒定，其操作過程繁雜、效率低、準確度不高[1]?？焖?、準確的鑒定白菜自交不親和性以及所攜帶的S單元型（在遺傳上由具有復等位基因的多態(tài)性S位點基因控制的單元類型），不僅可以加速自交親和系和自交不親和系的選育進程，而且可以做到有針對性地配制雜交組合、提高育種效率、避免雜交不結(jié)實現(xiàn)象發(fā)生。

自交不親和現(xiàn)象是植物在長期進化過程中促進異花授粉、保證物種生存、延續(xù)的生殖特性。根據(jù)遺傳控制不同，顯花植物的自交不親和特性大致可分成配子體自交不親和（Gametophytic self-incompatibility，GSI）與孢子體自交不親和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）2種類型[2]。配子體自交不親和是植物界最普遍的一種自交不親和類型，而孢子體自交不親和僅存在于十字花科、石竹科（Caryophyllaceae）、菊科（Compositae）等植物中。蕓薹屬是十字花科孢子體控制型的典型代表，研究表明，蕓薹屬植物自交不親和性受單位點（S-locus）復等位基因（S1，S2，……，Sn）的控制，在白菜自交不親和研究中已鑒定出100多種S單元型[3， 4]。目前，自交不親和機理研究認為，自交不親和現(xiàn)象的發(fā)生是花粉與柱頭乳突細胞間的自我識別引起的，其識別過程主要體現(xiàn)為S單倍型特異性的受體-配體識別機制，參與這一識別過程的蛋白主要包括：S位點糖蛋白基因（S locus glycoprotein gene，SLG基因）、S位點受體激酶基因（S locus receptor kinase gene，SRK基因）、花粉蛋白外殼基因（S locus cysteine-rich protein gene，SCR基因）。其中SLG和SRK為柱頭表達蛋白基因，SCR為花粉壁中存在的特異因子基因，3個緊密連鎖的基因參與了花粉和柱頭間的相互識別[5-7]。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展及蕓薹屬植物自交不親和性的深入研究，若干S單元型SLG、SRK和SCR基因序列也已確定。隨著DNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展，通過生物信息學分析，白菜自交不親和S單元型分子水平的快速鑒定也已成為可能。

試驗利用已公布的SRK、SLG基因特異引物的PCR擴增、克隆測序及生物信息學分析等技術(shù)，對4份引進的小白菜自交不親和材料A1、A2、A3、A4的S單元型進行分子鑒定，以期為小白菜雜交組合的授粉配制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的不結(jié)球白菜自交不親和材料A1，A2，A3及A4都從國外引進，由武漢市蔬菜科學研究所提供。離心柱型PCR產(chǎn)物回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體購于寶生物工程 （大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取各材料的幼嫩葉片，利用改良的CTAB小樣法提取4份試驗材料的基因組DNA，置于-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 利用已報道的特異性引物PS5和PS15，該引物是由Nishio等[8]設(shè)計的用于擴增ClassⅠ類（S單元型在花粉中表現(xiàn)為顯性）SLG的引物，特異引物P3和P4是張愛芬[9]設(shè)計用于擴增ClassⅡ類（S單元型在花粉中表現(xiàn)為隱性）SRK基因的引物，引物序列見表1，引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.3 PCR擴增 分別以4份材料的基因組DNA為模板，PCR 反應(yīng)體系為20 μL。擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s， 35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳產(chǎn)物檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 目的片段的回收及克隆 利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對目的片段進行回收，將回收DNA片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli）上，進行藍白斑篩選，對陽性克隆進行PCR鑒定。

1.2.5 測序及序列分析 對于鑒定的陽性克隆送樣測序，每個樣品測定2～3 個陽性克隆，測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司實施。序列分析利用DNAstar 軟件完成；Blast分析通過NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 S單元型相關(guān)基因的PCR擴增

利用蕓薹屬ClassⅠ類S單元型SLG基因特異性引物組合PS5+PS15及ClassⅡ類SRK基因特異性引物組合P3+P4對4份自交不親和材料A1、A2、A3、A4進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。從圖1可見，A1材料只在PS5+PS15引物組合中有擴增產(chǎn)物，A4只在P3+P4引物組合中有擴增產(chǎn)物，而A2、A3在2對引物擴增條件下都有特異性條帶出現(xiàn)。以上結(jié)果表明，A1可能屬S單元型中的ClassⅠ類，A4則屬于ClassⅡ類S單元型。A2和A3的擴增結(jié)果表明在這2份不親和材料中很有可能包括了2類S單元型，在S位點表現(xiàn)為雜合類型。為了進一步對以上結(jié)果進行驗證，對上述4份自交不親和材料中擴增出的目標片段進行回收，并分別連接到pMD18-T載體上，進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆進行序列測定。

2.2 自交不親和材料擴增序列的Blast分析

將4份自交不親和材料擴增產(chǎn)物的DNA序列測定結(jié)果與NCBI已登錄的蕓薹屬核苷酸序列進行Blast比對，以進一步確定它們的S單元型。Blast分析表明，自交不親和材料A1由PS5+PS15引物所擴增出的1 356 bp的片段經(jīng)克隆測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)，其與甘藍（B. oleracea L. var. capitata L.）SLG-31（GenBank 登錄號 AB054729.1）在序列覆蓋率為94%的情況下，相似度為98%（E值是0）。而與白菜S位點蛋白1基因（GenBank 登錄號 HM629338.1）在序列覆蓋度為80%的情況下，與其CDS序列相似度達到了99%（E值是0）。以上結(jié)果顯示，自交不親和材料A1的S位點基因序列在較高的序列覆蓋度情況下，與甘藍SLG-31具有較高的相似度；而與白菜蛋白基因1所屬的S單元型在較低的序列覆蓋度下序列相似度更高。因此，要準確鑒定其S單元型，需要進一步的試驗來驗證。

自交不親和材料A2在2對引物擴增條件下都有擴增條帶產(chǎn)生，包括1 356 bp及1 046 bp 2條特異性擴增條帶。對1 394 bp的序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，該序列與白菜的S位點糖蛋白SLG-30基因（GenBank登錄號 D85217.1）及蕪菁（B. rapa L.ssp.rapifera Matzg）的S位點受體激酶基因SRK-30 （GenBank登錄號AB054693.1）的序列具有很高的相似度，分別為99%和98%。因此基本可以確定不親和材料包含S30這一單元型。對1 059 bp片段的序列比對后發(fā)現(xiàn)，其與蕪菁SRK-60、SLG-60基因（GenBank 登錄號 AB097116.1）在覆蓋度為99%的情況下，相似度也高達99%，遠遠高于其他單元型，因此可以確定該序列屬于S60單元型。所以自交不親和材料A2基本上可以確定其具備S30、S60這2種S單元型，再一次證明自交不親和材料A2在S位點為雜合狀態(tài)。

自交不親和材料A3也如A2材料，在ClassⅠ類及ClassⅡ類S單元型引物中都擴增出了對應(yīng)的目的條帶，分別為1 356 bp及1 046 bp。對2條序列的分析結(jié)果表明，前者與蘿卜（Raphanus sativus L.）SGT-63基因（GenBank登錄號 EF056499.1）在序列覆蓋率為98%的條件下，序列相似度為99%；后者則與青花菜（B. oleracea L. var. italica Plenck）單倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登錄號 JQ253785.1）具有98%的序列相似度，序列覆蓋度達99%。以上結(jié)果表明，不親和材料A3在S位點也證實為雜合狀態(tài)。

自交不親和材料A4屬于ClassⅡ類S單元型，對其1 046 bp片段的序列分析結(jié)果（圖2）表明，自交不親和材料A4所包含的ClassⅡ類S位點基因序列與自交不親和材料A3中的S位點基因序列一致，2個材料應(yīng)包含同一類型的S基因。

3 討論

白菜為典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢顯著。利用自交不親和系制種，主要靠不同單倍型自交不親和系之間的互配來獲得，因此對于育種工作者來說，獲得自交不親和系單倍型的快速鑒定至關(guān)重要。目前已有很多鑒定自交不親和性的方法，主要包括：親和指數(shù)法[10]、熒光顯微法[11]、等電點聚焦電泳法[12]、免疫測定法[13]、RFLP-PCR（Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈式反應(yīng)）分子鑒定法[9]。以上方法難以對所研究材料進行準確的S單元型鑒定。隨著DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，以及公開報道的S單元型序列的增多，使得通過PCR擴增后直接測序來判定自交不親和材料的S單元型成為可能。分子鑒定法能夠?qū)崿F(xiàn)早期對植株自交不親和性S單元型的鑒定，從而大大提高了檢測效率，避免了雜交不結(jié)實現(xiàn)象的發(fā)生，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用SLG及SRK基因的保守序列設(shè)計的引物，對4份不結(jié)球白菜進行了S單元型的分子鑒定，結(jié)果表明，該方法基本可以鑒定出4份材料的S單元型類型，其中發(fā)現(xiàn)ClassⅠ類和ClassⅡ類S單元型同時出現(xiàn)在自交不親和材料A2和A3中，這種現(xiàn)象在前人的研究中也有相關(guān)的報道。張愛芬[9]對16份不結(jié)球白菜材料S單元型的鑒定中，發(fā)現(xiàn)有11份材料同時擴增出ClassⅠ類和ClassⅡ類2種類型，自交不親和S位點處于雜合狀態(tài)；這種現(xiàn)象也曾在白菜的一些自交不親和系中出現(xiàn)過，其原因可能是由于其自交不親和性導致其自我結(jié)實困難、而外來花粉在繁殖過程中又極易侵入、造成在表型上很難加以區(qū)分基因位點的雜合與否所產(chǎn)生的[14]；因此，出現(xiàn)了很多親本材料在S位點上并不是完全純合的現(xiàn)象。所以在進行新的不親和種質(zhì)資源引進及繁殖不親和材料時，應(yīng)該嚴防外來花粉的侵入，做好隔離措施，以保證其純度，同時輔以分子技術(shù)手段快速實現(xiàn)其S單元型的鑒定，從而提高不親和材料系的選育及組合選配效率。

此外，在對4份白菜自交不親和材料的S單元型鑒定的過程中還發(fā)現(xiàn)，在做S位點基因序列分析時，其中大部分序列與甘藍、蘿卜等其他十字花科作物中所包含的的S位點基因序列表現(xiàn)出了極高的相似度。例如，在自交不親和材料A3中其1 356 bp片段的序列分析結(jié)果表明，A3與蘿卜S位點糖蛋白SGT-63基因（GenBank登錄號 EF056499.1）在序列覆蓋度為98%的條件下，序列相似度為99%；而自交不親和材料A4所包含的S基因序列與青花菜單倍型BOI1 SRK蛋白基因（GenBank登錄號 JQ253785.1）具有98%的序列相似性，序列覆蓋度達99%。在十字花科不親和研究中，通過比較基因組研究發(fā)現(xiàn)，青花菜和蕪菁的S位點基因具有高度的相似性，白菜中S單倍型S46、S47、S8分別和甘藍的3種S單倍型S7、S12、S32在SRK基因方面均有高度的相似性，種間雜交發(fā)現(xiàn)它們之間也表現(xiàn)出相同的自交不親和識別特異性[15]。同樣蘿卜屬（Raphanus L.）作物蘿卜也具有和蕓薹屬作物高度同源的SLG、SRK和SP11基因，經(jīng)過核酸序列的聚類分析并不能將兩者分開。這些數(shù)據(jù)表明，十字花科S位點基因的多態(tài)性在蕓薹屬和蘿卜屬分化成不同的種屬以前已經(jīng)形成，并很可能來自于共同的祖先[16]。本研究中，4份自交不親和材料所包含的幾種S單元型，從基因組序列分析的結(jié)果來看，與甘藍及蘿卜中的一些S位點基因序列相似度很高，是不是具有相同的識別特異性，還有待進一步通過試驗來證實。

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