飛蝗LmGSTS2的酶學(xué)特性及其對(duì)馬拉硫磷、 p,p’-DDT的代謝分析

馬雯，劉嬌，張學(xué)堯，申國華，秦雪梅，張建琴

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飛蝗LmGSTS2的酶學(xué)特性及其對(duì)馬拉硫磷、’-DDT的代謝分析

馬雯1，劉嬌2，張學(xué)堯2，申國華3，秦雪梅1，張建琴1

（1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006；2山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；3山西省食品藥品檢驗(yàn)所，太原 030001）

【目的】將飛蝗（）谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶sigma2（glutathione--transferases sigma2，LmGSTS2）在大腸桿菌中原核表達(dá)后進(jìn)行純化，研究LmGSTS2的酶學(xué)特性，并分析其對(duì)馬拉硫磷和’-DDT的代謝作用。結(jié)合飛蝗體內(nèi)的RNA干擾及殺蟲劑生物學(xué)測(cè)定，評(píng)估LmGSTS2對(duì)殺蟲劑的代謝解毒能力，為飛蝗抗性治理及合理施藥提供理論依據(jù)?！痉椒ā繉mGSTS2在BL21(DE3)中表達(dá)，通過Ni-NTA親和層析對(duì)LmGSTS2進(jìn)行純化，以CDNB為底物檢測(cè)LmGSTS2在不同溫度和pH條件下的酶活性變化。在最適條件下（pH=7，27℃），用純化的LmGSTS2蛋白與馬拉硫磷和’-DDT進(jìn)行孵育，通過超高效液相色譜（UPLC）評(píng)估LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷和’-DDT的代謝解毒能力。進(jìn)一步將3 μg ds注入2齡飛蝗若蟲體內(nèi)，24 h后檢測(cè)目的基因的沉默效率，并結(jié)合殺蟲劑生測(cè)試驗(yàn)分析飛蝗對(duì)殺蟲劑敏感度的變化?！窘Y(jié)果】將LmGSTS2在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)與兩個(gè)對(duì)照組pET28a/BL21(DE3)和未誘導(dǎo)的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2相比，誘導(dǎo)后的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2總蛋白在25 kD左右出現(xiàn)與目標(biāo)蛋白大小相符的單一條帶，表明LmGSTS2成功表達(dá)。對(duì)純化后LmGSTS2蛋白的酶學(xué)特性研究結(jié)果表明，其最適反應(yīng)pH范圍為6—8，在pH=7時(shí)酶活性達(dá)到頂峰；最適反應(yīng)溫度范圍為25—30℃，27℃時(shí)活性最高。在最適條件下，LmGSTS2分別與馬拉硫磷和’-DDT進(jìn)行孵育。UPLC結(jié)果顯示，與3個(gè)對(duì)照組相比（GSH+insecticide、active LmGSTS2+insecticide及inactive LmGSTS2+GSH+ insecticide），LmGSTS2組馬拉硫磷色譜峰面積分別降低83.6%、84.0%和84.6%，差異顯著（＜0.05），而’-DDT色譜峰面積與對(duì)照組相比無顯著變化（＞0.05），說明LmGSTS2可對(duì)馬拉硫磷進(jìn)行代謝，對(duì)’-DDT無代謝作用。進(jìn)一步通過RNA干擾結(jié)合殺蟲劑生測(cè)在飛蝗體內(nèi)檢測(cè)LmGSTS2蛋白對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒作用。將靶標(biāo)基因的雙鏈RNA注入2齡飛蝗若蟲體內(nèi)，24 h后可使飛蝗體內(nèi)表達(dá)量抑制96%。飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，基因沉默后飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感度增加，死亡率由29.9%上升至45.2%，表明LmGSTS2參與了馬拉硫磷在體內(nèi)的代謝解毒過程。【結(jié)論】將LmGSTS2在體外進(jìn)行表達(dá)純化，并以CDNB為底物檢測(cè)到該酶最適反應(yīng)條件為pH=7，27℃左右；對(duì)馬拉硫磷的體內(nèi)和體外檢測(cè)結(jié)果顯示，LmGSTS2參與馬拉硫磷在飛蝗體內(nèi)的代謝解毒過程；對(duì)’-DDT的體外研究結(jié)果顯示該酶不參與’-DDT的代謝。

飛蝗；殺蟲劑；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；超高效液相色譜；RNA干擾

0 引言

【研究意義】飛蝗（）是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要以禾本科和莎草科植物（如小麥、水稻等）為食，嚴(yán)重危害我國中西部地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]。在控制蝗災(zāi)過程中，不同種類殺蟲劑的使用，不僅污染了農(nóng)作物及環(huán)境，而且殺蟲劑殘留還會(huì)影響人類健康，同時(shí)使飛蝗對(duì)殺蟲劑的抗性逐漸增強(qiáng)[2]。馬拉硫磷（malathion）為一種高效、低毒的有機(jī)磷殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[3]；滴滴涕（chlorophenothane，DDT）為一種高效、高毒的有機(jī)氯殺蟲劑，由于其不易降解，目前已禁止在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，但其在土壤等環(huán)境的殘留已導(dǎo)致中藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留[4]。課題組前期研究表明，飛蝗馬拉硫磷抗性品系的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-- transferases，GST，E.C.2.5.1.18）的活性顯著提高[5]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶是一類重要的Ⅱ相代謝酶，可參與昆蟲體內(nèi)物質(zhì)代謝及生理功能的調(diào)節(jié)[6]。昆蟲GST的存在部位主要為脂肪體、中腸、表皮、馬氏管等組織內(nèi)，其在重要解毒器官等組織中特異地高表達(dá)提示GST存在潛在的解毒功能[7-9]。大量的研究表明，昆蟲體內(nèi)GST可以通過脫氯化氫作用，將高毒的DDT代謝為無毒的DDE，以減小DDT對(duì)昆蟲機(jī)體的毒害作用。因此，明確飛蝗體內(nèi)解毒酶GST對(duì)殺蟲劑的代謝特性，一方面對(duì)于建立新型的害蟲防治體系、促進(jìn)環(huán)境綠色友好及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[10]，另一方面對(duì)于開發(fā)基于解毒酶的基因工程菌用于中藥材農(nóng)殘脫除技術(shù)研究具有重要意義[4]。【前人研究進(jìn)展】基于GST家族基因的序列相似性、底物特異性和免疫學(xué)特性，昆蟲GST分為6類：sigma、epsilon、delta、theta、omega和zeta[11-13]。目前已經(jīng)報(bào)道多種sigma、epsilon和delta家族的GST廣泛參與昆蟲對(duì)多種殺蟲劑的代謝過程[14-16]。RIVERON等將不吉按蚊（）GSTe2在果蠅中過表達(dá)后，增強(qiáng)了果蠅對(duì)DDT和氯菊酯的抗性，通過體外表達(dá)及純化證實(shí)GSTe2可直接對(duì)氯菊酯進(jìn)行代謝，并通過L119F點(diǎn)突變進(jìn)一步證實(shí)了GSTe2對(duì)于DDT的解毒功能[17]；LUMJUAN等發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊（）中GSTe2和GSTe5具有脫氯化氫酶活性，可將DDT代謝為無毒的DDE；通過RNAi技術(shù)證實(shí)GSTe7和GSTe2可能參與了擬除蟲菊酯殺蟲劑的代謝過程[18]。目前飛蝗中已知的GST共有32個(gè)，其中胞質(zhì)GST共28個(gè)，包括10個(gè)sigma家族GST，5個(gè)epsilon家族GST，7個(gè)delta家族GST，3個(gè)omega家族GST，2個(gè)theta家族GST和1個(gè)zeta家族GST[7]。QIN等用溴氰菊酯處理飛蝗48 h后檢測(cè)其體內(nèi)GST表達(dá)量發(fā)現(xiàn)多種sigma家族GST表達(dá)量均上調(diào)，說明sigma家族GST很可能共同參與了飛蝗體內(nèi)溴氰菊酯的代謝解毒[19]。另外，通過RNAi沉默后，飛蝗對(duì)于馬拉硫磷和西維因的敏感度增加，死亡率分別上升28%和26%；沉默后，西維因?qū)ζ渲滤缆噬仙?8.7%，表明sigma家族GST可能參與馬拉硫磷和西維因的解毒過程[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】sigma家族GST在各類殺蟲劑的代謝解毒過程中均不同程度發(fā)揮著作用，但飛蝗中尚缺乏對(duì)GST解毒酶體內(nèi)和體外代謝解毒能力的系統(tǒng)研究。ZHANG等[7]通過RT-qPCR研究發(fā)現(xiàn)（HM131837.1）在中腸、馬氏管和脂肪體等負(fù)責(zé)消化和解毒的組織中表達(dá)量最高，因此，本文選擇飛蝗sigma家族中的LmGSTS2（AEB91974.1）進(jìn)行研究，將其在體外表達(dá)并純化，通過超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）檢測(cè)LmGSTS2對(duì)殺蟲劑馬拉硫磷和’-DDT的代謝能力，并在飛蝗體內(nèi)對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】LmGSTS2表達(dá)后，探索合適的純化條件獲得高純度的蛋白，利用超高效液相色譜分別對(duì)馬拉硫磷及’-DDT進(jìn)行檢測(cè)，分析LmGSTS2對(duì)殺蟲劑的代謝能力。進(jìn)一步通過RNAi沉默飛蝗體內(nèi)的，檢測(cè)其對(duì)殺蟲劑的敏感度變化，從而通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)系統(tǒng)闡明LmGSTS2對(duì)殺蟲劑的代謝解毒作用。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2018年在山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心及應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 儀器、材料與試劑

儀器：?KTATMpure蛋白純化系統(tǒng)購于GEHealthcare公司；Synergy MX Microplate Reader酶標(biāo)儀購于BioTek公司；1290 Ⅱ超高效液相色譜儀購于Agilent公司；LightCycler?480購于ROCHE公司。材料：pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[22]。試劑：T7 RNA合成試劑盒購于NEB公司；SYBR?Green real-time PCR Master Mix購于TOYOBO公司；2×Taq PCR Master Mix購于天根公司；馬拉硫磷、’DDT標(biāo)準(zhǔn)品購于CATO公司。

1.2 LmGSTs2的原核表達(dá)及純化

將保存菌液劃線于固體LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇。復(fù)蘇后，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素）試管中，在37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14—16 h，作為種子菌液。按1﹕100的比例吸取種子菌液接種于液體LB培養(yǎng)基中（含50 μg·mL-1卡那霉素），置于37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol·L-1），置于16℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白大量表達(dá)；20 h后，離心收集菌體沉淀，經(jīng)PBS（文中PBS均為0.1 mol·L-1，pH 7.0）清洗3遍；加入PBS 20 mL，置于冰上超聲破碎至溶液透亮。12 000 r/min，4℃離心30 min，收集上清即為粗酶液。

經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定LmGSTS2成功表達(dá)后，使用HisTrap FF預(yù)裝柱，通過?KTATMpure蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。用含有不同濃度咪唑（60—250 mmol·L-1）的緩沖液洗脫。對(duì)粗蛋白及不同洗脫組分進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)含有較單一目的條帶的洗脫組分通過PBS緩沖液進(jìn)行超濾，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LmGSTS2的最適條件測(cè)定

1.3.1 酶活性測(cè)定 按照HABIG等[23]的方法進(jìn)行LmGSTS2活性測(cè)定。取10 μL待測(cè)酶液與190 μL混合液（5 mmol·L-1GSH﹕200 mmol·L-1CDNB=188﹕2），立即用酶標(biāo)儀在340 nm處記錄OD值（每隔 10 s計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)1 min）。10 μL PBS緩沖液作為空白對(duì)照，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。CDNB的摩爾消光系數(shù)為ε340=9.6 mmol·L-1·cm-1。

1.3.2 pH對(duì)LmGSTS2活性的影響 配制pH 為3—9的緩沖液，參照1.3.1以CDNB為底物測(cè)定LmGSTs2在不同pH緩沖液中的活性。以PBS作為空白對(duì)照，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 溫度對(duì)LmGSTS2活性的影響 取LmGSTs2酶液分裝于多個(gè)PCR管內(nèi)，分別置于20、30、40、50、60℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，4℃保存。參照1.3.1測(cè)定不同溫度處理后LmGSTS2活性。樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷和p,p’-DDT的代謝檢測(cè)

1.4.1 超高效液相色譜方法的建立 樣品檢測(cè)色譜條件見表1。兩種殺蟲劑洗脫方式均為等度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水。

1.4.2 重組LmGSTS2蛋白對(duì)不同殺蟲劑的代謝解毒功能分析 樣品分為A、B、C和D 4組。A組為正常反應(yīng)組（active LmGSTS2+GSH+insecticide）；B組以PBS緩沖液代替蛋白，為無蛋白對(duì)照組（GSH+ insecticide）；C組為不含GSH的對(duì)照組（active LmGSTS2+insecticide）；D組將煮沸后的蛋白作為對(duì)照組（inactive LmGSTS2+GSH+insecticide）。混勻后，置于27℃，1 200 r/min，溫育3 h；反應(yīng)結(jié)束后加入400 μL乙腈，27℃，1 200 r/min，溫育5 min終止反應(yīng)；將樣品于13 000 r/min，室溫離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至1.5 mL色譜瓶，參照1.4.1方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品均平行制備3份，之后對(duì)不同組殺蟲劑峰面積變化通過Student’s-test進(jìn)行顯著性分析。每組樣品制備時(shí)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

1.5 LmGSTs2基因沉默后飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感度分析

1.5.1PCR擴(kuò)增及dsRNA合成 根據(jù)已知的基因序列，使用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)dsRNA合成引物及RT-qPCR引物，引物的詳細(xì)信息見表2，所有引物均由生工生物公司合成。

以含有目的基因全長cDNA 序列的菌液為模板，以dsRNA引物擴(kuò)增雙鏈DNA。取PCR產(chǎn)物，在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段大小，并進(jìn)行回收純化。參照T7 RNA合成試劑說明書合成ds，將其濃度調(diào)整為1.5 μg·μL-1左右，備用。

表1 超高效液相色譜檢測(cè)殺蟲劑條件

表2 LmGSTs2 dsRNA引物及RT-qPCR引物序列

小寫字母表示T7啟動(dòng)子 The lowercases indicate T7 promoters

1.5.2 ds24 h干擾效率檢測(cè) 選取飛蝗2齡第3天大小均一、健康狀況良好的若蟲為試蟲。使用微量注射器沿第2—3腹節(jié)節(jié)間膜處注射，試驗(yàn)組注射2 μL（3 μg）目的基因dsRNA，對(duì)照組注射2 μL ddH2O，每組注射12頭若蟲，24 h后收集飛蝗，3頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取RNA通過RT-qPCR檢測(cè)ds沉默效率。

RT-qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：4.0 μL cDNA（10倍稀釋），上、下游引物各0.4 μmol·L-1，10 μL SYBR?Green real-time PCR Master Mix，其余體積以ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95℃ 1 min；40 cycles：95℃ 15 s，60℃ 31 s；95℃ 1 min，55℃ 1 min，97℃ continuous；37℃ 30 s。內(nèi)參基因?yàn)椤?/p>

1.5.3 ds沉默后飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感度變化檢測(cè) 試驗(yàn)分為兩組：對(duì)照組（注射2 μL ddH2O），試驗(yàn)組（注射3 μg ds），每組注射50頭2齡若蟲，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)12—14頭，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在注射dsRNA后的24 h，使用移液槍在蟲體腹部側(cè)面第2—3腹節(jié)的右側(cè)點(diǎn)滴馬拉硫磷（0.1 mg·mL-1）3 μL。點(diǎn)滴殺蟲劑后的24 h，記錄各組蟲體死亡數(shù)。采用Student’s-test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 LmGSTS2的原核表達(dá)及純化

采用SDS-PAGE法檢測(cè)LmGSTS2的表達(dá)，結(jié)果顯示相對(duì)于BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pET-28a空載體的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞及未誘導(dǎo)的pET28a/ BL21(DE3)-LmGSTS2，誘導(dǎo)后的pET28a/BL21(DE3)- LmGSTS2在25 kD左右出現(xiàn)一條明顯的條帶（黑色箭頭所指位置），為LmGSTS2目的條帶（圖1-A）。

Ni-NTA親和層析不同洗脫組分電泳結(jié)果顯示，在純化時(shí)，泳道2（過柱穿透液）中無目的條帶，說明LmGSTS2基本與Ni柱完全結(jié)合；經(jīng)不同濃度咪唑緩沖液洗脫后，雜蛋白主要在60—200 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫組分（3—8泳道）中洗脫，目標(biāo)蛋白（黑色箭頭所指位置）在250 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫組分（9—12泳道）中洗脫，條帶單一，可用于后續(xù)活性檢測(cè)（圖1-B）。

M：10—180 kD蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 10-180 kD protein molecular weight standards。A：LmGSTS2的表達(dá) Expression of LmGSTS2。1：BL21(DE3)；2：pET28a/BL21(DE3)；3：未誘導(dǎo)pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2 pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2before induction；4：誘導(dǎo)后的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2 pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2after induction。B：LmGSTS2的純化 Purification of LmGSTS2。 1：未純化的LmGSTS2總蛋白Total protein of LmGSTS2 before purification；2：過柱穿透液 Flow through fraction；3—12：不同濃度咪唑緩沖液洗脫組分Elution components with different concentrations of imidazole buffer

2.2 LmGSTS2酶活性的最適條件測(cè)定

將純化后的蛋白通過超濾進(jìn)行脫除咪唑及NaCl，以1-氯-2,4-二硝基苯（1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB）為底物研究LmGSTS2在不同條件下的酶活性變化，用OriginPro 8.0進(jìn)行曲線擬合（采用B-Spline連接方式），其結(jié)果見圖2。由圖2-A可知，LmGSTS2最適pH范圍為6—8，pH=7時(shí)活性最高。在pH＜5時(shí)幾乎沒有活性，pH介于5—7時(shí)隨著pH的上升活性逐漸升高，pH＞7時(shí)隨著pH的上升酶活性逐漸降低。由圖2-B可知，在25—30℃LmGSTS2活性較高，27℃左右時(shí)活性最高，溫度＞30℃時(shí)活性逐漸降低，在50℃時(shí)幾乎完全喪失活性。因此，LmGSTS2的最適反應(yīng)條件為pH=7，27℃左右。

圖2 不同條件下LmGSTS2活性變化

2.3 LmGSTS2對(duì)殺蟲劑的代謝檢測(cè)

將LmGSTS2與馬拉硫磷反應(yīng)，通過UPLC檢測(cè)不同組別代謝物。與對(duì)照組B—D相比，A組中馬拉硫磷色譜峰降低（保留時(shí)間2.13 min）（圖3），且A組峰面積分別降低83.6%、84.0%和84.6%，差異顯著（＜0.05）（表3）。而B、C和D 3組間馬拉硫磷峰面積均無明顯變化，說明在3 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，LmGSTS2和GSH共同作用，可將大部分馬拉硫磷代謝。但在色譜圖中未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物峰。

將LmGSTS2與’-DDT反應(yīng)，通過UPLC檢測(cè)不同組別代謝物。與對(duì)照組B—D相比，A組中’-DDT（保留時(shí)間3.14 min）峰無明顯差異，且沒有新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)（圖4），各組間峰面積無顯著變化，表明LmGSTS2不代謝’-DDT（表3）。

2.4 LmGSTs2基因沉默后飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感度分析

向2齡飛蝗若蟲注射3 μg ds，24 h后檢測(cè)其沉默效率，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，處理組表達(dá)量顯著降低，目標(biāo)基因的沉默效率達(dá)96%（圖5-A）。

沉默飛蝗體內(nèi)的后，點(diǎn)滴馬拉硫磷， 24 h后檢測(cè)飛蝗敏感度變化，結(jié)果顯示靶標(biāo)基因沉默后，飛蝗死亡率由29.9%上升至45.2%（圖5-B）。

A: active LmGSTS2+GSH+malathion; B: GSH+malathion; C: active LmGSTS2+ malathion; D: inactive LmGSTS2+GSH+malathion

表3 不同組間殺蟲劑色譜峰面積

表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（=3），*表示與A組相比差異顯著（＜0.05）

Data in the table are mean±SE (=3). * indicates significantly different compared with group A (＜0.05)

A: Active LmGSTS2+GSH+ p,p’-DDT; B: GSH+ p,p’-DDT; C: Active LmGSTS2+ p,p’-DDT; D: Inactive LmGSTS2+GSH+ p,p’-DDT

A：dsLmGSTs2沉默效率 Silencing efficiency of dsLmGSTs2。**: P＜0.01 (t-test)；B：飛蝗對(duì)馬拉硫磷敏感度分析 Sensitivity of L. migratoria to malathion。*: P＜0.05 (t-test)

3 討論

解毒酶在體外超表達(dá)對(duì)于更好地研究酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)殺蟲劑的代謝作用具有重要意義。WAN等[24]將甜菜夜蛾（）中的SeGSTe在體外進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組后的SeGSTe對(duì)重金屬Cu2+和Cd2+敏感，且酶活性被多種農(nóng)藥顯著抑制，進(jìn)而推測(cè)SeGSTe可能參與體內(nèi)的氧化應(yīng)激及殺蟲劑的解毒過程；LIAO等[25]將柑橘全爪螨（）中的PcGSTm5在體外進(jìn)行原核表達(dá)后，確定其對(duì)CDNB及GSH具有代謝活性，并通過dsRNA干擾試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)與殺蟲劑阿維菌素（abamectin）抗性間的相關(guān)性；ZHANG等[7]對(duì)飛蝗LmGSTS2的前期研究中，檢測(cè)了LmGSTS2在不同底物下的活性及其組織分布，發(fā)現(xiàn)在中腸、馬氏管和脂肪體等具有消化和解毒的組織中表達(dá)量最高，推測(cè)LmGSTS2可能參與飛蝗體內(nèi)和體外物質(zhì)代謝。為進(jìn)一步深入闡明LmGSTS2對(duì)農(nóng)藥的代謝作用，本研究將LmGSTS2成功在大腸桿菌中表達(dá)，通過Ni-NTA親和層析獲得單一的LmGSTS2蛋白，分析了酶的最適反應(yīng)條件，研究了LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷和’-DDT等殺蟲劑的代謝作用，并通過RNAi結(jié)合馬拉硫磷生物學(xué)測(cè)定，進(jìn)一步在飛蝗體內(nèi)驗(yàn)證了LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒特性。

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，LmGSTS2成功表達(dá)。通過Ni-NTA親和層析純化獲得單一的目的條帶。對(duì)其在不同條件下的活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LmGSTS2在pH=7，27℃左右時(shí)活性最高。飛蝗的體液pH為7.0左右，最適生長溫度為28—30℃，其生活條件為體內(nèi)酶發(fā)揮作用提供了最適條件。QIN等[20]對(duì)LmGSTs5的酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)pH為6—9，溫度為20—40℃；李帥等[26]檢測(cè)到梨小食心蟲（）中GmolGST6在pH=7.5和40℃時(shí)活性最高；HIROWATARI等[27]檢測(cè)到斜紋夜蛾（）中SlituGST7和SlituGST20的最適反應(yīng)范圍為pH 6—8，30—50℃。不同物種間GST最適反應(yīng)條件不同，可能與昆蟲自身生理?xiàng)l件及蛋白的組織分布相關(guān)。

目前殺蟲劑代謝檢測(cè)方式主要有液相、氣相及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[28-31]，本研究將純化的LmGSTS2蛋白在體外分別與馬拉硫磷和’-DDT進(jìn)行孵育，通過超高效液相色譜對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，LmGSTS2可代謝馬拉硫磷，但不能代謝’-DDT。進(jìn)一步通過RNAi沉默后，飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感度增加15.3%，表明LmGSTS2參與馬拉硫磷在飛蝗體內(nèi)的代謝解毒過程，從飛蝗體內(nèi)驗(yàn)證了體外代謝的結(jié)果。GST參與外源及內(nèi)源毒性物質(zhì)代謝作用主要分為4種：（1）GST可以催化GSH與殺蟲劑的結(jié)合，生成毒性較小的可溶性綴合物[32-33]。NAKKA等[34]通過HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)長芒莧（）中的GST可催化GSH與阿拉特津結(jié)合生成綴合物，從而對(duì)除草劑表現(xiàn)出抗性；（2）GSH作為輔助因子可特異性地催化DDT直接代謝為無毒DDE，從而完成對(duì)DDT的解毒[35-36]，WANG等[35]發(fā)現(xiàn)岡比亞按蚊（）中的agGSTe2具有DDT代謝活性，agGSTe2結(jié)合GSH后對(duì)DDT發(fā)起親核攻擊將其代謝為DDE從而消除毒性；（3）GST可以減少由殺蟲劑攝入引起的氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的有毒過氧化物，因而表現(xiàn)出過氧化物酶特性[37]。LUMJUAN等[38]發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊（）重組后的GSTE2-2酶除了參與殺蟲劑解毒作用之外，還可參與脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物的代謝，具有過氧化物酶活性；（4）GST可通過結(jié)合并包裹殺蟲劑，從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性[11,18]。本研究中，LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷代謝過程中未檢測(cè)到產(chǎn)物生成，可能是目前采用的色譜條件不適合馬拉硫磷代謝產(chǎn)物的分離，后續(xù)需進(jìn)一步對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而鑒定產(chǎn)物。GONZALEZ等[39]對(duì)黑腹果蠅（）中GSTD2進(jìn)行蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析，通過分子對(duì)接模擬分析了天然殺蟲劑異硫氰酸酯（isothiocyanates，ITC）與GSTD2三維結(jié)構(gòu)的相互作用；LOW等[40]通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)了黑腹果蠅中GSTD1、GSH與DDT的作用位點(diǎn)，并通過二維核磁共振1H、15N對(duì)結(jié)合前后構(gòu)象進(jìn)行解析，從而闡明GSTD1、GSH與DDT的作用方式。因此，在今后的研究中，將通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析，進(jìn)一步闡明LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷的代謝解毒機(jī)制。

4 結(jié)論

將LmGSTS2在體外進(jìn)行表達(dá)純化，并以CDNB為底物檢測(cè)到該酶最適反應(yīng)條件為pH=7，27℃左右，該條件與飛蝗體內(nèi)環(huán)境較為一致，表明飛蝗體內(nèi)環(huán)境為酶發(fā)揮作用提供了最適條件；通過超高效液相色譜分析表明LmGSTS2可代謝馬拉硫磷，進(jìn)一步RNAi和殺蟲劑的生測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示基因沉默后飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感度增加，表明在飛蝗體內(nèi)LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷具有一定的代謝作用。據(jù)此分析，LmGSTS2對(duì)馬拉硫磷的代謝活性可能是飛蝗對(duì)馬拉硫磷產(chǎn)生抗藥性的原因之一。研究結(jié)果可為飛蝗抗性治理和合理施用殺蟲劑提供重要依據(jù)。

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Enzymatic Characteristics and Metabolic Analysis to Malathion and’-DDT of LmGSTS2 from

MA Wen1, LIU Jiao2, ZHANG XueYao2, SHEN GuoHua3, QIN XueMei1, ZHANG JianQin1

(1Modern Research Center For Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;3Shanxi Provincial Institute for Food and Drug Control, Taiyuan 030001)

【Objective】Glutathione-transferase sigma2 (LmGSTS2) fromwas expressed inand purified in order to analyze the enzymatic characteristics. The objective of this research was to study the effect of LmGSTS2 on malathion and’-DDT metabolism. The detoxification ability of LmGSTS2 was assessed by usingRNA interference (RNAi) and insecticide bioassay. It will provide a theoretical basis for management of locust resistance and rational insecticide application.【Method】LmGSTS2 was expressed in BL21 (DE3) cells and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The activities of LmGSTS2 under different conditions (temperature and pH) were detected using CDNB as substrate. Under the optimal conditions (pH 7, 27℃), malathion and’-DDT were incubated with purified LmGSTS2 protein. The metabolic detoxification ability of LmGSTS2 to malathion and’-DDT was evaluated by ultra performance liquid chromatography (UPLC). Furthermore, 3 μg of dswas injected into 2nd instar nymph,RNAi efficiency ofwas tested at 24 h after dsinjection and the sensitivity ofto malathion was analyzed at 24 h after malathion exposure.【Result】LmGSTs2 was induced to express in. After SDS-PAGE detection, it was found that an extra band around 25 kD in the total protein of pET28a/BL21 (DE3)-LmGSTS2 after induction compared with pET28a/BL21(DE3) and uninduced pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2, which is regarded as the target protein size, indicating that LmGSTS2 was successfully expressed in the bacteria. The results of the study on the enzymatic characteristics of the purified LmGSTS2 protein showed that the optimum reaction pH was 6-8, the enzyme activity reached the peak at pH=7, the optimum reaction temperature was 25-30℃, and the activity was the highest at 27℃. LmGSTS2 was exposed to malathion and’-DDT respectively at pH 7, 27℃. The results of UPLC showed that the peak area of malathion after incubation with LmGSTS2 decreased by 83.6%, 84.0% and 84.6%, respectively, compared with GSH+insecticide, active LmGSTS2+insecticide and inactive LmGSTS2+GSH+insecticide (＜0.05). However, there was no significant change in the peak area of’-DDT compared with the control group (＞0.05), indicating that LmGSTS2 could metabolize malathion, but had no effect on the metabolism of’-DDT. The role of LmGSTS2 in the detoxification process of malathion was further verified by RNA interference. The dsRNA of the target gene was injected into the 2nd instar nymph. After 24 h, the mRNA expression ofwas inhibited by 96%. The sensitivity test showed that compared with the control group, the sensitivity ofto malathion increased after gene silencing, and the mortality increased from 29.9% to 45.2%, indicating that LmGSTS2 was involved in the detoxification process of malathion in. 【Conclusion】LmGSTS2 was expressed and purified, and the optimal reaction condition of the enzyme was pH=7, 27℃using CDNB as substrate.andassays for malathion metabolism showed that LmGSTS2 was involved in themetabolic detoxification in.assay for’-DDT metabolism showed that LmGSTS2 was not involved in the metabolism of’-DDT.

; insecticide; glutathione--transferases; ultra performance liquid chromatography (UPLC); RNA interference (RNAi)

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.009

2018-11-23；

2018-12-27

國家自然科學(xué)基金國際合作項(xiàng)目（30810103907）、山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（201601D202058）、2016省級(jí)配套國家科研項(xiàng)目（226546001）、地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（201605D111004）

馬雯，E-mail：15135902986@163.com。 通信作者秦雪梅，E-mail：qinxm@sxu.edu.cn。通信作者張建琴，E-mail：jiangqinzh3@sxu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）