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    嬰兒糞便中益生菌的分離篩選及培養(yǎng)

    2019-05-07 03:41:46鄭麗君吳秀英李洪亮
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年7期
    關(guān)鍵詞:膽鹽乳酸桿菌胃液

    鄭麗君,吳秀英,李洪亮,孫 濤

    (內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 011517)

    0 引言

    益生菌是一類可以對(duì)宿主細(xì)胞起到有益作用的活性微生物,定植在人體腸道和生殖系統(tǒng)中[1],分為乳酸菌類、雙歧桿菌類、革蘭氏陽(yáng)性雙歧桿菌。研究顯示,人體中微生物種類約30個(gè)種屬,大多集中在大腸中。人體健康與胃腸道微生物種群的種類與數(shù)量,尤其是生長(zhǎng)于大腸內(nèi)的微生物種群有直接關(guān)系[2]。

    剛出生的嬰兒消化系統(tǒng)近似無(wú)菌,僅有少量腸桿菌定植。經(jīng)母乳喂養(yǎng)后就會(huì)有大量微生物開始定植,在2 d內(nèi)糞便里就能檢測(cè)到腸桿菌、金色葡萄菌等[1],再過(guò)3~4 d,雙歧桿菌也開始定植于腸道。有研究顯示正常母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒在1月齡時(shí),雙歧桿菌為優(yōu)勢(shì)菌,同時(shí)還有大量的大腸桿菌和乳酸桿菌。隨著生長(zhǎng),雙歧桿菌數(shù)量略有增加,仍為優(yōu)勢(shì)菌[3]。此時(shí),乳酸桿菌數(shù)量逐漸增加,大腸桿菌在6月齡時(shí)明顯下降,以后相對(duì)平穩(wěn),總體變化是從需氧菌和兼性厭氧菌占優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變到厭氧菌占優(yōu)勢(shì)。益生菌種類中雙歧桿菌、乳酸桿菌一直都是健康嬰兒腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。

    雙歧桿菌和乳酸桿菌的益生作用廣受關(guān)注,雙歧桿菌能否耐受胃酸、腸液和膽汁是影響其益生功能的關(guān)鍵因素,由于來(lái)自人體的雙歧桿菌較易在人體腸道中定植,所以研究旨在從嬰兒糞便中進(jìn)行分離、培養(yǎng)雙歧桿菌和乳酸桿菌并鑒定其生長(zhǎng)特性,再?gòu)闹泻Y選出具有潛在益生特性的純菌株,為益生菌產(chǎn)業(yè)應(yīng)用于發(fā)酵食品提供更多的菌種資源和參考依據(jù)。

    1 益生菌種的培養(yǎng)與篩選

    1.1 樣本

    河南省洛陽(yáng)市母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便(2個(gè)月內(nèi)),采樣期嬰兒均無(wú)腸胃不適癥狀,采樣前2周內(nèi)未服用過(guò)任何藥物。

    1.2 分離培養(yǎng)試驗(yàn)方法

    1.2.1 乳酸桿菌分離純化

    將嬰兒新鮮糞便挑取5~10 g,裝入甘油管并轉(zhuǎn)移至放有生物冰袋的冷藏箱中待用。在無(wú)菌操作臺(tái)將已厭氧保存的嬰兒糞便樣1 g,轉(zhuǎn)移至裝有9 mL的無(wú)菌生理鹽水中并至均勻,依次進(jìn)行10倍的梯度稀釋到 1×10-8,用移液槍吸取 1×10-6,1×10-7,1×10-83個(gè)梯度的稀釋液各100 μL于固體培養(yǎng)基MRS-CaCO3中,每個(gè)稀釋度平行3個(gè)平板[4]。放入真空培養(yǎng)皿中抽真空,然后充入CO2,反復(fù)2次,模擬厭氧環(huán)境,此外每一個(gè)梯度用1個(gè)平板在空氣中培養(yǎng)做對(duì)照。然后在恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置平板,于37℃恒溫下培養(yǎng)48 h后,挑取表面具備乳酸桿菌特性的菌落,接種到MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);重復(fù)上述步驟,然后進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)鏡檢,確定為革蘭氏陽(yáng)性菌株為純菌株后,再活化一代,并進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。利用這樣的方法培養(yǎng)2次,得到在液體培養(yǎng)基中為較純的乳酸菌菌種。把最后得到的乳酸菌菌種在MRS液體培養(yǎng)基中放入4℃冰箱保存待用[5]。

    根據(jù)乳酸桿菌基本特征,在液體培養(yǎng)基中找到符合上述特點(diǎn)的5個(gè)純菌株暫時(shí)定為乳酸桿菌[6]。

    1.2.2 5株乳酸桿菌基本信息

    5株乳酸桿菌菌株鏡檢、菌落特征、菌落形態(tài)見表1。

    1.2.3 雙歧桿菌的分離純化

    表1 5株乳酸桿菌菌株鏡檢、菌落特征、菌落形態(tài)

    樣品處理過(guò)程同乳酸桿菌,培養(yǎng)基改良MRS培養(yǎng)基。

    根據(jù)雙歧桿菌特征從液體培養(yǎng)基中得到5株符合上述特點(diǎn)的菌株,暫定為雙歧桿菌[7]。

    1.2.4 5株雙歧桿菌基本信息

    5株雙歧桿菌菌株初步檢測(cè)基本信息見表2。

    表2 5株雙歧桿菌菌株初步檢測(cè)基本信息

    2 乳酸桿菌菌株和雙歧桿菌菌株鑒定

    2.1 5株乳酸桿菌的益生鑒定

    根據(jù)細(xì)菌屬水平和種水平的分類鑒定程序,選擇鏡檢中無(wú)分叉的G+桿菌,將其傳代純化培養(yǎng),在pH值4.5的酸度下可適應(yīng)酸度生長(zhǎng),過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性,即鑒定其為乳酸桿菌屬,由于乳酸桿菌鑒定結(jié)果一樣,所以可近似一致。除了屬水平試驗(yàn)鑒定,還需有種水平的鑒定才是完整的鑒定過(guò)程[8]。

    2.1.1 基礎(chǔ)試驗(yàn)鑒定(5株乳酸桿菌同步進(jìn)行)

    吲哚鑒定試驗(yàn)中,乙醚和培養(yǎng)物相互作用后未出現(xiàn)紅色環(huán)狀物,可初步確定是陰性,符合基本特征;需氧鑒定試驗(yàn)中,將接種管與空氣中接觸培養(yǎng)后,培養(yǎng)液有少許渾濁現(xiàn)象,且管底有部分菌體沉淀,可判斷菌株為兼性厭氧;明膠鑒定液化試驗(yàn),將已接種的接種管和未接種的對(duì)照試管一起放于冰箱中,待對(duì)照管凝固時(shí),對(duì)照接種管也同時(shí)凝固,可判斷為陰性反應(yīng),符合基本特征。

    2.1.2 耐膽鹽鑒定試驗(yàn)

    將經(jīng)過(guò)活化的菌株按培養(yǎng)基2%的接種量接種在膽鹽質(zhì)量濃度依次是0,0.3,0.6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,依次測(cè)各組菌株菌液的OD600nm值。

    5株純?nèi)樗釛U菌菌株在不同膽鹽質(zhì)量濃度含量時(shí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的OD600nm值見表3。

    表3 5株純?nèi)樗釛U菌菌株在不同膽鹽質(zhì)量濃度含量時(shí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的OD600 nm值

    經(jīng)過(guò)試驗(yàn)可知,在膽鹽質(zhì)量濃度為0.3,0.6 g/L時(shí),對(duì)5株乳酸桿菌生長(zhǎng)都有明顯的抑制作用,但經(jīng)過(guò)2種培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)24 h后,5株菌均能繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖,僅RS1生長(zhǎng)稍差,由此可知這5株菌均具有一定的耐膽鹽能力,基本符合文獻(xiàn)和綜述。

    2.1.3 溫度敏感鑒定試驗(yàn)

    菌株經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)后,以培養(yǎng)基2%的接種量接種在5個(gè)含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中。分別設(shè)置溫度為45,50,55,60℃,處理30 min,其中1管不進(jìn)行相關(guān)溫度處理,只作為空白對(duì)照組[9],其余試管在37℃恒溫培養(yǎng)生化箱中培養(yǎng)16 h,測(cè)各試管中菌液的OD600nm值。

    5株乳酸桿菌在不同溫度處理后的生長(zhǎng)情況見表4。

    表4 5株乳酸桿菌在不同溫度處理后的生長(zhǎng)情況

    經(jīng)過(guò)試驗(yàn)測(cè)定可知,可知對(duì)溫度試驗(yàn)敏感的菌株有RS1,其他菌株經(jīng)過(guò)不同的溫度培養(yǎng)處理后,生長(zhǎng)繁殖情況未出現(xiàn)明顯變化。RS5除了在60℃處理后生長(zhǎng)很緩慢,其他溫度下處理后都表現(xiàn)出不影響菌株生長(zhǎng)的繁殖狀態(tài)。

    2.1.4 模擬胃腸道耐受試驗(yàn)

    把MRS液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至3.0,然后經(jīng)過(guò)115℃滅菌30 min后在無(wú)菌超凈臺(tái)上操作,添加胃蛋白酶5 mg/mL和5%的NaCl,調(diào)配制成模擬人體胃液。把MRS液體培養(yǎng)基pH值調(diào)配成8.0,于115℃下滅菌30 min,并放入豬膽鹽為培養(yǎng)基含量0.3%的濃度,無(wú)菌超凈臺(tái)中操作,添加胰蛋白酶10 mg/mL和0.5%的NaCl,調(diào)配制成模擬人體腸液。把試驗(yàn)菌液以培養(yǎng)基含量為10%的接種量分別加到人體模擬胃腸液中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱模擬培養(yǎng)胃液2 h,腸液3 h[10]。

    5株乳酸桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受性見表5。

    表5 5株乳酸桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受性/×108CFU·mL-1

    由試驗(yàn)結(jié)果可知,5株乳酸桿菌菌株在經(jīng)過(guò)pH值3.0酸度胃液處理2 h后和pH值8.0的腸液處理3 h后,活菌數(shù)量均有減少,但是都保持了同步的增長(zhǎng)趨勢(shì),由此可以說(shuō)明5株乳酸桿菌菌株對(duì)于模擬的胃液、腸液都具有良好的耐受能力,其中RS3表現(xiàn)較強(qiáng)。

    2.1.5 抑菌鑒定試驗(yàn)

    將已經(jīng)活化好的乳酸桿菌菌株、大腸桿菌和沙門氏菌菌株分別以培養(yǎng)基含量為2%的接種量同時(shí)接種10 mL的MRS液體培養(yǎng)基試管中。于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。此次培養(yǎng)運(yùn)用平板活菌計(jì)數(shù)的方法,37℃下過(guò)夜培養(yǎng),菌落表現(xiàn)為紅色的大菌落是大腸桿菌菌體,白色的菌落為沙門氏菌[11]。通過(guò)記錄大腸桿菌、沙門氏菌的菌落數(shù)量,計(jì)算每一個(gè)試驗(yàn)菌株對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌試驗(yàn)的抑菌率。

    5株乳酸桿菌菌株分別對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用情況見表6。

    表6 5株乳酸桿菌菌株分別對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用情況

    由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,5株乳酸桿菌菌株與一起培養(yǎng)24 h的大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率均達(dá)了到97%~100%,由此可見,這5株乳酸桿菌對(duì)生長(zhǎng)在同一微生物環(huán)境中的生態(tài)具有抑制作用。

    2.2 5株雙歧桿菌益生鑒定

    2.2.1 分類鑒定程序

    對(duì)雙歧桿菌屬水平的鑒定過(guò)程中,一般常用將經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)純化得到的雙歧桿菌菌株先進(jìn)行屬水平的鑒定。選擇鏡檢中無(wú)分叉的G+桿菌。這些無(wú)分叉的G+桿菌經(jīng)過(guò)傳代純化培養(yǎng)后,在pH值4.5的酸度下可生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)屬水平的生理生化試驗(yàn)就可以初步認(rèn)為是乳酸桿菌。由于對(duì)照菌種中的雙歧桿菌特性和這些鑒定結(jié)果一樣,可確認(rèn)為是雙歧桿菌。除了屬水平試驗(yàn)鑒定,還需進(jìn)行種水平鑒定,如模擬人體胃腸道等。

    2.2.2 基礎(chǔ)試驗(yàn)鑒定

    KOH鑒定試驗(yàn):拿起接種環(huán)后沒(méi)有拉絲現(xiàn)象出現(xiàn),則判斷試驗(yàn)菌株雙歧桿菌為KOH陰性菌;吲哚鑒定試驗(yàn):在乙醚與培養(yǎng)物之間未產(chǎn)生紅色環(huán)狀物,則測(cè)試菌株為陰性;需氧鑒定試驗(yàn):經(jīng)接種管培養(yǎng)后,培養(yǎng)液呈清澈,試管底部出現(xiàn)大量菌體沉淀,由此可判斷雙歧桿菌為嚴(yán)格厭氧菌;明膠鑒定液化試驗(yàn);將經(jīng)過(guò)接種培養(yǎng)的接種管和未接種的對(duì)照試管一起置于冰箱中,當(dāng)對(duì)照管凝固時(shí)接種管也會(huì)凝固,由此可判斷為陰性反應(yīng)。

    2.2.3 雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線

    在測(cè)生長(zhǎng)曲線時(shí),將經(jīng)過(guò)活化的5株雙歧桿菌菌株以培養(yǎng)基1%的接種量接種在MRS液體培養(yǎng)基,并于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,每2 h取樣測(cè)定1次,OD600nm下測(cè)定吸光度,繪制生長(zhǎng)曲線。

    5株雙歧桿菌在37℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線見圖1。

    圖1 5株雙歧桿菌在37℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線

    由圖1中5株雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線可知,屬于正常生長(zhǎng)曲線,符合文獻(xiàn)綜述描述。

    2.2.4 對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行耐酸性菌株的初步篩選試驗(yàn)

    將活化的雙歧桿菌分別接種于改良的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,利用改良的MRS培養(yǎng)液連續(xù)傳代培養(yǎng)2~3次后,取10 mL雙歧桿菌培養(yǎng)液,以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心30 min,收集得到菌體懸液,重復(fù)進(jìn)行1次,加入到盛有5 mL滅菌PBS中振勻得到菌體懸液,再用移液槍吸取菌體懸液0.2 mL接種于5 mL,pH值分別是3.0,3.5和4.0的改良MRS液體培養(yǎng)基中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h,觀察其生長(zhǎng)情況,選擇此條件下生長(zhǎng)良好的菌株。

    培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)情況見表7。

    由表7可知,所選的5株雙歧桿菌均有一定的耐酸性,SQ1在生長(zhǎng)中表現(xiàn)最好,可選為優(yōu)秀菌種進(jìn)行更深入研究,貯藏待用。

    2.2.5 人工胃液鑒定試驗(yàn)

    雙歧桿菌菌體液1.0 mL與pH值為3.0的人工胃液9.0 mL混合后,于37℃下水浴培養(yǎng),分別在0,3 h后,取樣用MRS瓊脂培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)法,測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率,篩選出存活率在98%以上的菌株,進(jìn)一步做pH值2.5人工胃液耐受性測(cè)定,篩選出存活率在85%以上的菌株進(jìn)行人工消化液的耐受性測(cè)定,然后再進(jìn)行pH值2.0時(shí)的生長(zhǎng)測(cè)定,每個(gè)樣品做3個(gè)平行[12]。

    表7 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)情況

    5株雙歧桿菌在pH值3.0人工胃液中的生長(zhǎng)情況見表8。

    表8 5株雙歧桿菌在pH值3.0人工胃液中的生長(zhǎng)情況

    由表8可知,SQ1生長(zhǎng)最好。

    2.2.6 耐膽鹽基礎(chǔ)液的制備方法

    MRS液體培養(yǎng)基中添加3.0 g/L牛膽鹽和2.0 g/L巰基乙酸鈉,將活化后的菌株按2%接種量接種于膽鹽質(zhì)量濃度依次為0.3~2.0 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃下恒溫培養(yǎng)16 h,測(cè)出各組菌液的OD600nm。

    5株雙歧桿菌對(duì)不同質(zhì)量濃度膽鹽的耐受性見表9。

    表9 5株雙歧桿菌對(duì)不同質(zhì)量濃度膽鹽的耐受性

    由表9可知,在質(zhì)量濃度為0.3~2.0 g/L的膽鹽含量對(duì)5株雙歧桿菌菌生長(zhǎng)均存在抑制,但SQ1表現(xiàn)最好。

    2.2.7 模擬胃腸道耐受試驗(yàn)

    配制模擬人體胃液和腸液,將試驗(yàn)菌液以培養(yǎng)基10%的接種量分別放入模擬人體胃腸液中,放入恒溫生化培養(yǎng)箱中,于37℃條件下,胃液培養(yǎng)2 h,腸液培養(yǎng)3 h[8]。利用平板計(jì)數(shù)法來(lái)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)前后培養(yǎng)液中雙歧桿菌的活菌數(shù)量。

    5株雙歧桿菌在模擬人體胃液和腸液中2 h消化后的活菌數(shù)見表10。

    由表10可知,5株雙歧桿菌菌株培養(yǎng)液中都出現(xiàn)了比較顯著的生長(zhǎng)現(xiàn)象。其中,SQ1在人工腸液和人工胃液中的耐受性最高,可作為優(yōu)良的菌株保藏待用,有更多的益生效果可以開發(fā)。

    表10 5株雙歧桿菌在模擬人體胃液和腸液中2 h消化后的活菌數(shù)

    3 結(jié)論

    通過(guò)對(duì)河南省洛陽(yáng)市母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便進(jìn)行分離培養(yǎng),得到具有益生特性的乳酸桿菌和雙歧桿菌純菌種。試驗(yàn)經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)初步得到5株雙歧桿菌和5株乳酸桿菌。根據(jù)進(jìn)一步的種水平和屬水平的試驗(yàn),最終找出了雙歧桿菌和乳酸桿菌各1株具有益生特性的菌種。

    對(duì)分離的雙歧桿菌菌株和乳酸桿菌株進(jìn)行更多耐酸和耐氧馴化試驗(yàn),使其成為能夠安全食用并應(yīng)用于生產(chǎn)的優(yōu)良菌株,為呵護(hù)人類健康提供優(yōu)質(zhì)的益生菌,將會(huì)是未來(lái)極具潛力的研究課題。

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