HS-SPME-GC-MS結(jié)合自動解卷積技術(shù)分析阿膠中的揮發(fā)性成分

張鵬云李 蓉龍春霞林淑綿張 峰

(1. 中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528400；2. 廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣東 中山 528458；3. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176)

阿膠(CollaCoriiAsini) 是一種名貴的中藥材，又名驢皮膠、盆覆膠，由馬科動物驢 (EquusasinusL.)的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮而制成[1]。阿膠被稱為補(bǔ)血圣藥，藥食兩用，在臨床上可用于治療妊娠胎漏、勞嗽咯血、肺燥咳嗽，便血崩漏等疾病[2]。藥理研究表明，阿膠具有增加白細(xì)胞[3]、補(bǔ)血造血[4]、抗衰老[5]等作用。而阿膠在提取過程中驢皮中的膠原蛋白不斷水解，水解程度不同，提取物的粗糙感、雜質(zhì)含量、儲存時間、堿性揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)程度也不同，就會產(chǎn)生不同質(zhì)量的阿膠產(chǎn)品[6]。此外阿膠帶有濃重的腥氣，氣味并不能被大多數(shù)人接受，但是根據(jù)其腥氣的化學(xué)組成進(jìn)行針對性調(diào)控，可以改善阿膠的風(fēng)味[7]。因此，研究阿膠的揮發(fā)性成分不但有助于理解阿膠的藥物作用機(jī)制，還可以用來判斷其質(zhì)量，改善其風(fēng)味，對阿膠產(chǎn)品的研發(fā)與發(fā)展有重要的指導(dǎo)意義。

近年來，中國已有學(xué)者對阿膠香氣成分有所研究，如毛跟年等[8]對阿膠腥味物質(zhì)進(jìn)行了分析，鑒定出23種物質(zhì)；王進(jìn)等[9]分析了 3個品牌阿膠揮發(fā)性成分，共鑒定出49種成分，并利用氣相色譜—嗅聞技術(shù)鑒定出14種活性香氣成分；佘遠(yuǎn)斌等[10]比較了5個品牌阿膠香氣成分的特征與差異，并鑒定出65種化合物，但上述揮發(fā)性成分是由蒸餾法或同時蒸餾萃取法制得，操作復(fù)雜并使用大量溶劑。雖然肖作兵等[11]曾利用頂空—固相微萃取法提取了9種阿膠揮發(fā)性物質(zhì)，但是未分析不同因素對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響，且在定性過程中只運(yùn)用了譜庫對照。而阿膠揮發(fā)性成分復(fù)雜，色譜分離能力又有限，一些極性相似的組分色譜峰會重疊，僅根據(jù)譜庫檢索來確認(rèn)化合物，會使定性結(jié)果不準(zhǔn)確[12]。

本研究擬采用頂空—固相微萃取法(head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME)提取阿膠揮發(fā)性成分，利用單因素和正交試驗(yàn)研究樣品量、萃取溫度、萃取時間、平衡時間、解吸時間對萃取效果的影響，并確定HS-SPME-GC-MS分析阿膠揮發(fā)性物質(zhì)的較優(yōu)條件。再利用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)對揮發(fā)性成分總離子流圖進(jìn)行解卷積處理，提取未知組分更“純凈”的質(zhì)譜圖，之后通過譜庫檢索匹配，結(jié)合保留指數(shù)(Retention index，RI)來定性[13-14]，使定性結(jié)果的準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高。旨在為阿膠揮發(fā)性成分的提取與鑒定提供參考方法，為阿膠的鑒別與品質(zhì)評價提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東阿阿膠塊(批號：1605003)：山東東阿阿膠，常溫儲存；

正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C7～C40)：美國O2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)聯(lián)儀(GC-MS/MS)： TSQ 8000型，配電子電離源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、TRIPLUS RSH自動進(jìn)樣器，美國Thermo Fisher公司；

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；

2014 NIST 2.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫：美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃取法 先將阿膠塊粉碎，然后準(zhǔn)確稱取一定量阿膠粉末置于20 mL頂空瓶中(配有聚四氟乙烯墊的螺紋密封蓋)，自動進(jìn)樣器將頂空瓶放在具有一定溫度的孵化爐中平衡數(shù)分鐘后，將已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分進(jìn)行熱吸附，然后將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃條件下進(jìn)行解吸，最后進(jìn)入GC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測。

1.3.2 萃取條件的優(yōu)化 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目為考察指標(biāo)，研究不同因素對阿膠揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響。

(1) 樣品量：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取溫度50 ℃，萃取時間30 min，平衡時間10 min，解吸時間5 min的條件下，考察不同樣品量(2，3，4，5，6 g)的萃取效果，每個水平重復(fù)3次。

(2) 萃取溫度：在樣品量優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，考察不同萃取溫度(50，60，70，80，90 ℃)的萃取效果，每個水平重復(fù)3次。

(3) 萃取時間：在樣品量和萃取溫度優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，考察不同萃取時間(30，40，50，60 min)的萃取效果，每個水平重復(fù)3次。

(4) 平衡時間：在樣品量，萃取溫度和萃取時間優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，考察不同平衡時間(5，10，15，20 min)的萃取效果，每個水平重復(fù)3次。

(5) 解吸時間：在以上因素的優(yōu)化條件下，考察不同解吸時間(3，5，7，9 min)的萃取效果，每個水平重復(fù)3次。

1.3.3 GC-MS分析條件

(1) 色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持3 min；柱流速1.2 mL/min，分流比10∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純度(99.999%)氦氣。

(2) 質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子轟擊能量70 eV；全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z35～450，溶劑延遲3 min。

1.3.4 定性分析 應(yīng)用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)AMDIS對阿膠揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖(TIC)自動進(jìn)行反卷積處理，所分辨的質(zhì)譜在2014版NIST2.2標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索，根據(jù)匹配度和保留指數(shù)進(jìn)行核對，只選擇正匹配和反匹配均>800的物質(zhì)，并用峰面積歸一化法計(jì)算阿膠各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

保留指數(shù)是C7～C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)在和阿膠樣品相同的分析條件下進(jìn)樣后，自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時間，自動計(jì)算出各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HS-SPME條件的選擇

2.1.1 樣品量對萃取效果的影響 由圖1可知，隨著阿膠樣品量的增加，揮發(fā)性成分的總峰面積和峰數(shù)不斷增大。當(dāng)樣品量超過5 g時，揮發(fā)性成分的總峰面積和總峰數(shù)變化趨勢不明顯，這是因?yàn)榇藭r吸附和解吸附已達(dá)到平衡，揮發(fā)性成分處于飽和狀態(tài)，即使再多的樣品，揮發(fā)性成分的總量還是一定的。因此選擇5 g為較佳樣品量，不但保證了萃取效果，還節(jié)約了樣品。

圖1 樣品量對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Figure 1 Effect of sample amount on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響 由圖2可以看出，當(dāng)萃取溫度不斷升高時，阿膠揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積呈先上升后下降的趨勢，在70 ℃時達(dá)到最大值，而峰數(shù)目也呈先上升后降低的趨勢，但在80 ℃時達(dá)到最大值。這是因?yàn)闇囟壬呒涌炝藫]發(fā)性組分的擴(kuò)散速率，促進(jìn)了萃取頭對目標(biāo)物的富集吸附[15]。但萃取是一個放熱過程，高溫會降低揮發(fā)性物質(zhì)在萃取頭和樣品之間的分配系數(shù)，導(dǎo)致萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)的吸附量降低，另外高溫還可能使部分揮發(fā)性化合物發(fā)生變性或裂解，影響萃取結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。因此造成80 ℃時，揮發(fā)性物質(zhì)的峰數(shù)目較多而總峰面積卻下降的結(jié)果。綜合考慮，選擇萃取溫度為70 ℃。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響 由圖3可以看出，隨著萃取時間的延長，阿膠揮發(fā)性成分的峰數(shù)目基本保持不變，而總峰面積不斷增加。當(dāng)萃取時間為30～50 min 時，總峰面積上升趨勢顯著；當(dāng)萃取時間超過50 min 時，總峰面積變化不明顯，說明50 min時揮發(fā)性物質(zhì)已達(dá)到較平衡狀態(tài)。這可能是萃取時間過短時，揮發(fā)性化合物吸附不充分；萃取時間過長時，已經(jīng)被萃取頭吸附的組分可能脫附，降低了萃取效果[17]。綜合考慮，選擇萃取時間為50 min。

圖2 萃取溫度對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

圖3 萃取時間對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Figure 3 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.4 平衡時間對萃取效果的影響 由圖4可以看出，隨著平衡時間的延長，阿膠揮發(fā)性成分的總峰面積先增大后減小，在10 min時達(dá)到了最大值，而峰數(shù)目變化不明顯，在10 min 時略有增加而后基本保持不變。由此可以說明，當(dāng)平衡時間為10 min時，揮發(fā)性物質(zhì)在樣品和頂空部分已達(dá)到了較平衡的狀態(tài)，有利于萃取頭穩(wěn)定吸附。所以將平衡時間設(shè)定為10 min。

圖4 平衡時間對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Figure 4 Effect of equilibrium time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.5 解吸時間對萃取效果的影響 圖5顯示，隨著解吸時間的延長，阿膠揮發(fā)性成分的總峰面積和峰數(shù)目均呈先增加后減小的趨勢，且都在5 min時達(dá)到最大值。說明此時，揮發(fā)性組分已解吸完全，再延長時間反而會降低萃取效率。在同一解吸溫度下，解吸時間決定著揮發(fā)性化合物能否完全進(jìn)入氣相色譜柱。若解吸時間不夠，揮發(fā)性組分解吸不完全，萃取頭上有殘留，不但影響方法的靈敏度，還會使后續(xù)樣品分析受到污染；反之，當(dāng)解吸時間過長時，會導(dǎo)致峰形變寬，高溫下部分組分發(fā)生氧化，并且影響萃取頭的使用壽命[18]。因此，選擇解吸時間為5 min。

圖5 解吸時間對阿膠揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Figure 5 Effect of desorption time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定平衡時間為10 min，解吸時間為5 min，選擇萃取時間、萃取溫度和樣品量作為3個影響因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表2為正交試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)以總峰面積作為萃取效果的考察指標(biāo)時，由極差大小可知，3個因素對萃取效果的影響程度為B>A>C，即萃取溫度影響最大，萃取時間和樣品量影響次之，較優(yōu)組合是A2B2C2。當(dāng)以峰數(shù)目為指標(biāo)時，從極差結(jié)果來看，較優(yōu)組合同樣是A2B2C2，因素作用主次為B>C>A，即萃取溫度影響最大，樣品量次之。由此可以看出，當(dāng)考察指標(biāo)不同時，因素影響作用略有差異。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

由于正交表中沒有A2B2C2組合結(jié)果，所以需進(jìn)行A2B2C2的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出總峰面積為2 314 554 005，總峰數(shù)為58，該組合結(jié)果優(yōu)于正交表中的任何一個。因此，最終確定頂空—固相微萃取法萃取阿膠揮發(fā)性成分的較優(yōu)組合為A2B2C2，即：樣品量5 g、萃取溫度為70 ℃、萃取時間50 min、平衡時間10 min、解吸時間5 min。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

采用上述優(yōu)化的萃取條件，考察HS-SPME-GC-MS方法在分析阿膠樣品揮發(fā)性成分時的重復(fù)性，試驗(yàn)重復(fù)6次。經(jīng)計(jì)算，阿膠揮發(fā)性組分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.54%～10.40%，平均值為6.25%，說明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.4 優(yōu)化條件下阿膠揮發(fā)性成分的檢測分析

在選定的HS-SPME優(yōu)化條件下，對阿膠揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取，并通過GC-MS檢測分析，得到阿膠揮發(fā)性成分總離子流圖(圖6)，除去因萃取頭過熱和柱流失產(chǎn)生的少量硅氧烷類雜質(zhì)峰后，得到阿膠揮發(fā)性成分及相對百分含量，見表3。在較優(yōu)條件下阿膠共分離得到54種揮發(fā)性成分，并鑒定出其中41種成分，占揮發(fā)性成分總量的95.83%，主要包括10種吡嗪類化合物(48.95%)、8種醛類化合物(26.37%)、5種酯類化合物(8.18%)、6種酮類化合物(6.43%)及13種其他類化合物(5.90%)。其中含量最高的成分為2,5-二甲基吡嗪，占揮發(fā)性物質(zhì)總面積的20.35%，其次為壬醛(16.67%)、2,3,5-三甲基吡嗪(13.80%)、3-乙基-2,5-甲基吡嗪 (9.54%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(4.42%)、己醛(3.30%)、2-癸酮(3.23%)、苯甲醛(3.00%)、2-壬酮(1.95%)、2,2,4-三甲基戊二醇異丁酯(1.87%)，這10種成分共占阿膠揮發(fā)性物質(zhì)總含量的78.14%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 阿膠的揮發(fā)性成分?

? 參考值通過http://webbook. nist. gov /chemistry /搜索獲得。

圖6 阿膠揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖

吡嗪類化合物具有烤香、堅(jiān)果香、咖啡香等香味特征，是氨基酸和還原糖發(fā)生Maillard反應(yīng)形成的揮發(fā)性物質(zhì)，在食品風(fēng)味研究中具有重要價值[10]。由于阿膠的制作過程需要長時間加熱，所以產(chǎn)生了大量的吡嗪類化合物，本研究鑒定出了10種該類化合物。據(jù)報道[19]，吡嗪類化合物具有改善血循環(huán)、預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗組織纖維化和抗氧化等藥理作用。根據(jù)孫惜時等[20]的研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了本研究鑒定出的2-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪具有抗氧化活性。

經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定出的化合物種類與文獻(xiàn)[9～10]更為相似，主要為醛類和吡嗪類，但是含量差異較大。本研究中含量較高的壬醛、2,3,5-三甲基吡嗪、己醛、苯甲醛等化合物在文獻(xiàn)中的含量同樣較高， 而2-戊基呋喃在文獻(xiàn)中含量較高，但在本研究中含量相對較低，可能是由于阿膠的品牌、加工工藝不一致所致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了提取阿膠揮發(fā)性物質(zhì)的較優(yōu)條件為：50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、5 g阿膠樣品、萃取溫度70 ℃、萃取時間50 min、平衡時間10 min以及解吸時間5 min。在較優(yōu)條件下，鑒定出41種阿膠揮發(fā)性成分，主要為吡嗪類、醛類、酯類、酮類等化合物。本研究為阿膠的快速檢測、質(zhì)量鑒定、香味調(diào)控、產(chǎn)品研發(fā)提供參考，但是該研究未比較不同品牌阿膠揮發(fā)性成分的差異，因此在下一步研究中將利用本研究的方法建立阿膠揮發(fā)性成分指紋圖譜，比較不同品牌之間的差異與共性，并與新鮮驢皮的揮發(fā)性成分進(jìn)行對比，共同分析阿膠的質(zhì)量，為阿膠揮發(fā)性成分的研究提供更加豐富的數(shù)據(jù)。