UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定保健食品中洛伐他汀及其類似物

韓 智龔 蕾王會(huì)霞朱曉玲王 彬曹 琦吳婉琴

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430070； 2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心 湖北 武漢 430070)

保健食品亦稱功能性食品，具有調(diào)節(jié)人體功能的作用，但不以治療疾病為目的，適于特定人群食用[1]。據(jù)報(bào)道[2]，2018年中國(guó)保健品的產(chǎn)值達(dá)到4 000億元人民幣。高血脂等心腦血管疾病成為嚴(yán)重危害中國(guó)人民健康的隱形殺手，降血脂類保健食品在保健食品中占有重要地位。總黃酮、茶多酚、總皂苷、總蒽醌、粗多糖是降脂保健食品的主要功能因子，而銀杏葉、絞股藍(lán)、山楂、荷葉、澤瀉是使用頻率最多的原料[3]。市面上的保健食品名稱中常含有螺旋藻、大豆磷脂、魚(yú)油、沙蒜、紅曲等名詞，帶給消費(fèi)者營(yíng)養(yǎng)健康的感覺(jué)，受到目標(biāo)人群的青睞。然而，一些不法分子通過(guò)在保健食品中非法添加化學(xué)藥物，使其功效顯著，從而達(dá)到獲取高額利潤(rùn)的目的，此類非法添加物的含量往往具有隨意性，甚至超過(guò)相應(yīng)藥品的推薦服用劑量，可能導(dǎo)致消費(fèi)者發(fā)生輕微中毒，嚴(yán)重的甚至危及自身生命[4]。2018年5月，中國(guó)市場(chǎng)監(jiān)督管理總局公布了2017年7月以來(lái)全國(guó)各地保健食品整治案件信息，非法經(jīng)營(yíng)行為占全部案件總數(shù)高達(dá)45.19%，其中又以非法添加藥物為主[2]。他汀類藥物是目前最有效的降血脂藥物，是不法商家非法添加的首選。他汀類藥物通過(guò)阻斷羥甲戊酸代謝途徑，促使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成變少，從而刺激細(xì)胞膜表面低密度脂蛋白受體活性增加，加速清除血清膽固醇，從而達(dá)到降低血脂和治療動(dòng)脈粥樣硬化的目的[5-6]。

為保證降血脂類保健食品行業(yè)的良性發(fā)展，中國(guó)有關(guān)部門(mén)發(fā)布一系列保健食品監(jiān)督抽檢細(xì)則，降低保健食品的安全風(fēng)險(xiǎn)。2018版《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》[7]中明確將煙酸、洛伐他汀、辛伐他汀3種藥物列為日常監(jiān)督抽檢項(xiàng)目，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法為食藥監(jiān)辦許[2010]114號(hào)[8]，定量方法為高效液相色譜法。2018年10月，中國(guó)食品保健食品欺詐和虛假宣傳整治工作領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室發(fā)布《食品保健食品欺詐和虛假宣傳整治》問(wèn)答[9]，將美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、去羥基洛伐他汀作為輔助降血脂食品抽檢風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，未公布具體檢驗(yàn)方法。在文獻(xiàn)報(bào)道中，他汀類化合物常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)[12]、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]。這些檢測(cè)方法涵蓋洛伐他汀、辛伐他汀等常見(jiàn)的藥物，但是對(duì)去羥基洛伐他汀及羥基洛伐他汀羥酸鈉鹽的研究較少。于泓等[16]、鈕正睿等[17]采用超高效液相色譜—四級(jí)桿—飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)測(cè)定保健食品中的去羥基洛伐他汀及羥基洛伐他汀羥酸鈉鹽，但使用LC-MS/MS的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。相比于LC-TOF-MS而言，LC-MS/MS儀器價(jià)格相對(duì)廉價(jià)，方便快捷，許多實(shí)驗(yàn)室都有配備。因此開(kāi)發(fā)一種同時(shí)檢測(cè)洛伐他汀及其類似物的方法對(duì)促進(jìn)保健食品行業(yè)健康發(fā)展，保障食品安全具有重要意義。

本試驗(yàn)擬以5種常見(jiàn)輔助降血脂藥物為目標(biāo)，采用UPLC-MS/MS，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立定性、定量檢測(cè)輔助降血脂保健食品中5 種降血脂藥物的方法。并對(duì)17批市售的輔助降血脂功能保健食品進(jìn)行檢測(cè)，為降血脂類保健食品的安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀：規(guī)格為100 μg/mL，1 mL，美國(guó)First Standard公司；

去羥基洛伐他?。杭兌葹?8.0%，1 mg，美國(guó)First Standard公司；

洛伐他汀羥酸鈉鹽：純度為95.2%，10 mg，美國(guó)First Standard公司；

甲醇、乙腈：HPLC級(jí)，美國(guó)Merck公司；

17種輔助降血脂保健食品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀：Waters TQD型，美國(guó)Waters公司；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3型，50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國(guó)密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

渦旋振蕩器：Talboys型，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

高速離心機(jī)：Avanti JXN-30型，美國(guó)Beckman Coulter公司；

電子天平：ME204型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：S 180H型，德國(guó)Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 相關(guān)溶液的配制 分別精密量取800 μL濃度為100 μg/mL 的洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容至10 mL，配制濃度為8 μg/mL的單標(biāo)溶液。用甲醇溶解1 mg去羥基洛伐他汀，并轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶，定容，配制濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取洛伐他汀羥酸鈉鹽4 mg，用甲醇溶解，并定容到10 mL，配制濃度為400 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作液根據(jù)需要稀釋。

1.3.2 樣品前處理 參考《國(guó)食藥監(jiān)辦許[2010]114號(hào)》[8]的前處理方法并加以改進(jìn)。油狀膠囊：刺破膠囊，將內(nèi)容物擠出，混勻?？诜芤海喝⊥慌慰诜夯靹?。固體顆劑：用研缽將片劑研磨成粉狀，混勻。精密稱取混勻的樣品1.0 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約40 mL，混勻，超聲處理(功率800 W，頻率 37 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇定容到刻度，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 濾膜，備用。

空白基質(zhì)：精密稱取空白樣品適量，使用與樣品同樣的前處理方式，得到空白基質(zhì)。

1.3.3 超高效液相色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)為固定相；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，洗脫梯度為：0.0～0.5 min，B相保持90%，0.5～1.5 min，B相 90%～5%，1.5～3.0 min，B相保持5%，3.0～3.1 min，B相5%～90%，3.1～5.0 min，B相90%。柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.3 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；毛細(xì)管電壓：3 000(ESI+)，-2 500 V(ESI-)；源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)?

? *. 定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵分別將濃度為 1 μg/mL的5種標(biāo)準(zhǔn)品注入離子源，在全掃描模式下分別對(duì)5種化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、去羥基洛伐他汀采用正離子掃描模式響應(yīng)高，洛伐他汀羥酸鈉鹽采用正負(fù)離子掃描響應(yīng)均高，但后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用負(fù)離子掃描干擾小，故采用負(fù)離子掃描。分別對(duì)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，選取豐度強(qiáng)且干擾少的2對(duì)子離子，通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使相應(yīng)離子響應(yīng)達(dá)到最大值，得出最佳質(zhì)譜條件，見(jiàn)表1。

2.2 液相條件優(yōu)化

流動(dòng)相的組成會(huì)影響色譜峰形、分離度及靈敏度。LC-MS/MS分析中正離子模式通過(guò)添加甲酸，負(fù)離子通過(guò)添加氨水或易揮發(fā)緩沖鹽來(lái)提高離子化效率，通過(guò)改變流動(dòng)相洗脫梯度來(lái)分離化合物。本試驗(yàn)考察了水+乙腈、0.1% 甲酸水溶液+乙腈、水+甲醇、0.1%甲酸水+甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，5種目標(biāo)化合物離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度及色譜峰形。結(jié)果表明以0.1%甲酸水溶液+乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，5種化合物的響應(yīng)最高，峰形尖銳且對(duì)稱。還考察了流速為0.2，0.3，0.4 mL/min時(shí)的色譜圖，發(fā)現(xiàn)0.4 mL/min時(shí)峰形最尖銳，但系統(tǒng)壓力高，且靈敏度低于0.3 mL/min條件下的靈敏度，因此本試驗(yàn)采用0.3 mL/min流速。5種化合物的總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

UPLC-MS/MS是定性定量檢測(cè)保健食品中非法添加藥物的常用檢測(cè)方式，但這種檢測(cè)方式可能有基質(zhì)效應(yīng)，造成檢測(cè)方法不穩(wěn)定，結(jié)果不準(zhǔn)確。在實(shí)際檢測(cè)中，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為80%～120%時(shí)可忽略。本試驗(yàn)研究了3種不同類型的降血脂保健食品(油狀膠囊、口服溶液、固體顆粒)的基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，5種化合物在3種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)均為80%～120%，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍、檢出限及定量限 配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3的條件下進(jìn)行測(cè)定，以響應(yīng)為縱坐標(biāo)，化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性方程，得出5種物質(zhì)在一定線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.99，以3倍信噪比確定目標(biāo)化合物的檢出限，10倍信噪比確定目標(biāo)物的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 5種化合物的總離子流圖

表2 5種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3 5種化合物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4.2 方法的回收率及精密度 按0.05，0.50，1.00 mg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度水平對(duì)空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，按照本方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果(表3)顯示，5種化合物平均回收率為 94.6%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，該方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足分析要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)共檢測(cè)輔助降血脂類保健食品17批次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)某品牌大豆磷脂膠囊檢出洛伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、去羥基洛伐他汀，其含量分別為1 800.00，11.13，0.12 mg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)用UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定保健食品中5種洛伐他汀及其類似物，方法簡(jiǎn)便、快速，系統(tǒng)的方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便、回收率好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，能滿足降血脂類保健食品中洛伐他汀及其類似物的測(cè)定要求。但本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)臨床上常用的其它他汀類物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)，今后可以進(jìn)一步對(duì)保健食品中風(fēng)險(xiǎn)較大的他汀類物質(zhì)進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)。