山蒼子蛋白堿提工藝優(yōu)化及其功能性質(zhì)研究

張 園，仇超穎，汪 勇，何佳靜，張 震

(1.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東高校油脂生物煉制工程技術(shù)研究中心，廣州 510632；2.暨南大學(xué)-薩斯喀切溫大學(xué) “油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實(shí)驗室，廣州 510632；3.清遠(yuǎn)市瑤康生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 513200)

山蒼子(Litseacubeba)又名山雞椒、山姜子，是樟科(Lauraceae)木姜子屬落葉灌木。山蒼子在我國分布非常廣泛，在廣東、廣西、湖南等省廣泛種植，盛產(chǎn)期高達(dá)15 000～22 500 kg/hm2，是一類重要的山區(qū)資源。山蒼子根、莖、葉和果實(shí)均含有芳香油，均可入藥，山蒼子油中含檸檬醛、檸檬醇、有機(jī)酸等[1-2]。同時，山蒼子油具有抗菌[3]、抗氧化[4]、驅(qū)避昆蟲[5]和抗腫瘤[6]等多種生物活性。提取山蒼子精油后的核仁中含有40%左右的核仁油，其脂肪酸組成與椰子油相似，可廣泛用于制造食品級、化妝品級表面活性劑。將提取精油后的山蒼子果渣混在飼料中，能夠提高豬瘦肉率，有試驗表明，6%的山蒼子果渣餅粉對飼料的防霉效果與0.3%的丙酸相當(dāng)，防霉性能明顯優(yōu)于辣椒粉和桔皮粉，說明山蒼子果渣不僅可以直接作為飼料原料，而且還兼有飼料天然防腐劑的功能[7]。山蒼子除含極其豐富的油脂外，還含有20%～30%的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。

我國目前對山蒼子的研究多偏重于芳香油及核仁油方面，隨著山蒼子種植及加工業(yè)的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)生大量山蒼子廢棄粕，如何對粕中蛋白質(zhì)利用成為一個亟待解決的問題。目前對山蒼子綜合利用的研究報道相對較少。堿溶酸沉法是一種經(jīng)典的蛋白提取方式，尤其在種子、果實(shí)等作物的蛋白提取中應(yīng)用廣泛[8]。為了更好地對山蒼子資源綜合利用，提高其附加值，本文利用堿溶酸沉法對提取精油及核仁油后的山蒼子粕中蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，確定提取工藝參數(shù)，并測定山蒼子蛋白的起泡性、乳化能力、持水能力等功能性質(zhì)，以期為山蒼子蛋白的深入開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

山蒼子，由清遠(yuǎn)市瑤康生物科技有限公司種植基地提供；大豆食用油，市售；大豆分離蛋白，來自麥克林生化科技有限公司。氫氧化鈉、鹽酸、正己烷等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

KDC-1044低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；可調(diào)高速均質(zhì)器，金壇市晶玻實(shí)驗儀器廠；722s可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C精密pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；自動凱氏定氮儀，湖北正金儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫脂山蒼子粕制備

將山蒼子脫除果肉后粉碎過60目篩，用料液比1∶10(質(zhì)量體積比)的正己烷在功率為20%、室溫25℃ 條件下超聲浸提5 min，真空抽濾分離，將濾渣放置通風(fēng)櫥充分揮發(fā)至無正己烷殘留。

1.2.2 常規(guī)指標(biāo)檢測

水分測定參照GB 5009.3—2016；粗蛋白質(zhì)測定參照GB/T 14489.2—2008；粗脂肪測定參照NY/T 4—1982；灰分測定參照GB 5009.4—2016；粗纖維及其他物質(zhì)含量：100%-(水分含量+粗蛋白質(zhì)含量+粗脂肪含量+灰分含量)。

1.2.3 山蒼子蛋白等電點(diǎn)測定

稱取5 g脫脂山蒼子粕，在浸提pH 10、浸提溫度25℃、料液比1∶10條件下浸提60 min，3 500 r/min 離心20 min得到上清液，之后用1 mol/L HCl調(diào)溶液pH至4.0，離心得到沉淀，冷凍干燥得山蒼子粗蛋白。相同條件下進(jìn)行多次提取，合并提取的蛋白。稱取1.000 0 g粗蛋白，加入100 mL10 mmol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，分別調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、9.0，充分?jǐn)嚢? h，離心20 min(3 500 r/min)。取上清液，采用福林酚法在500 nm波長下測定吸光度，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中蛋白質(zhì)含量[9]。

1.2.4 山蒼子蛋白提取工藝

將脫脂山蒼子粕用NaOH溶液在一定溫度下浸提一定時間，3 500 r/min離心20 min得到上清液，之后用1 mol/L HCl調(diào)溶液pH至山蒼子蛋白等電點(diǎn)，離心得到沉淀，冷凍干燥即得山蒼子粗蛋白。山蒼子蛋白提取率根據(jù)如下公式計算。

提取率=山蒼子粗蛋白質(zhì)量×粗蛋白中蛋白質(zhì)含量/(山蒼子粕質(zhì)量×粕中蛋白質(zhì)含量)×100%

1.2 5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定[10]

稱取山蒼子粗蛋白0.400 g，溶解于20 mL蒸餾水中，測定此時溶液體積V0，分別調(diào)其pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫條件下磁力攪拌1 h，之后將溶液置于均質(zhì)機(jī)10 000 r/min剪切2 min，測定此時泡沫體積V1，并記錄均質(zhì)停止靜置30 min后泡沫體積V2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性計算公式如下。

起泡性=V1/V0×100%

泡沫穩(wěn)定性=V2/V0×100%

1.2.6 乳化性測定[11]

稱取0.400 g山蒼子粗蛋白溶于20 mL蒸餾水中，分別調(diào)其pH為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫磁力攪拌1 h，分別加入20 mL大豆油，在均質(zhì)機(jī)中以10 000 r/min攪打2 min，轉(zhuǎn)入50 mL離心管， 3 500 r/min離心20 min。根據(jù)乳化層高度(H1)和溶液總高度(H2)計算乳化性，計算方法如下。

乳化性=H1/H2×100%

1.2.7 持水性測定[10,12]

取50 mL塑料離心管，稱重為M1。分別稱取0.400 g山蒼子粗蛋白，置于離心管中，加入蒸餾水20 mL，調(diào)節(jié)pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，恒溫振蕩60 min。另將裝有山蒼子粗蛋白的離心管分別置于水浴鍋中30、45、60、75、90℃保溫30 min后在冷水中冷卻30 min。之后3 500 r/min離心20 min，傾倒去除上清液，稱取離心管的質(zhì)量M2。分別計算pH和溫度對蛋白質(zhì)持水力的影響。蛋白持水力計算公式如下。

持水力=(M2-M1-0.4)/0.4

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均為3組測定結(jié)果的平均值，采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析及作圖，利用SPSS 17.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂山蒼子粕主要成分(見表1)

表1 脫脂山蒼子粕主要成分 %

由表1可知，脫脂山蒼子粕中粗蛋白質(zhì)含量為37.30%，此外含有大量的粗纖維成分，主要是山蒼子核殼部分，同時含有10.80%的水分、4.07%的粗脂肪及2.71%的灰分。山蒼子粕中粗蛋白質(zhì)含量較高，可將其作為一種新型蛋白質(zhì)資源加以開發(fā)利用。

2.2 山蒼子蛋白等電點(diǎn)

不同pH下的山蒼子蛋白溶解度如圖1所示。

圖1 不同pH下山蒼子蛋白溶解度

由圖1可以看出，當(dāng)pH在3～5范圍內(nèi)時，山蒼子蛋白溶解度較低，最低值在pH 4.0左右，此時上清液中山蒼子蛋白溶解度僅為0.086 mg/mL，當(dāng)pH大于6.0時，山蒼子蛋白溶解度顯著增加，pH 7～8時，山蒼子蛋白溶解度為0.25 mg/mL左右，當(dāng)pH為9時，山蒼子蛋白溶解度增加至0.35 mg/mL。等電點(diǎn)時蛋白分子帶電荷最少，因此靜電斥力最小，蛋白聚集使溶解度最低，并形成沉淀[13]，故后續(xù)選取等電點(diǎn)4.0為山蒼子蛋白提取時的酸沉pH。山蒼子蛋白等電點(diǎn)與花生蛋白及其他大多數(shù)油料蛋白的等電點(diǎn)較為相似[14-15]。

2.3 山蒼子蛋白提取單因素試驗

2.3.1 浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響

在浸提溫度35℃、料液比1∶15和浸提時間60 min條件下，研究浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 浸提pH對山蒼子蛋白提取率的影響

從圖2可以看出，隨著浸提pH的提高，山蒼子蛋白提取率不斷升高。山蒼子蛋白組分多數(shù)為堿溶蛋白，隨浸提pH增大蛋白帶電荷增多，溶出能力提高，當(dāng)浸提pH升高到11以后，繼續(xù)增大浸提pH，山蒼子蛋白提取率增大幅度變緩，表明在浸提pH為11時山蒼子蛋白能夠溶出較多。強(qiáng)堿性條件下，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)特性易改變，易導(dǎo)致脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等化學(xué)反應(yīng)，生成賴氨酰丙氨酸等有毒物質(zhì)，造成營養(yǎng)物質(zhì)損失[16]；除此之外，強(qiáng)堿條件還會使蛋白質(zhì)變性和水解，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)，影響產(chǎn)品色澤和風(fēng)味[17-18]?？紤]到過高濃度的堿液會引入大量的離子，增加產(chǎn)品的鹽分[19]，故浸提pH選擇11為佳。

2.3.2 料液比對山蒼子蛋白提取率的影響

在浸提時間60 min、浸提溫度35℃、浸提pH 11條件下，研究料液比對山蒼子蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖3可以看出，山蒼子蛋白提取率隨料液比的增加而升高，當(dāng)料液比為1∶15時，山蒼子蛋白提取率最大，當(dāng)料液比為1∶5時提取率相對較低。這是因為當(dāng)料液比較低時，山蒼子粕膳食纖維吸水膨脹，不易攪動，降低了提取效率[20]。料液比升高至1∶20 時提取率無增長趨勢。此時浸提液較多，降低了蛋白質(zhì)分子在水中的擴(kuò)散作用，導(dǎo)致蛋白溶出下降，同時提取液中蛋白質(zhì)濃度偏低，也不利于蛋白提取后的酸沉過程[21]。綜合考慮，料液比選擇1∶15為佳。

2.3.3 浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響

在料液比1∶15、浸提溫度35℃、浸提pH 11條件下，研究浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提時間對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖4可以看出，延長浸提時間，山蒼子蛋白提取率會略微提高，但過長的浸提時間并不能有效提高提取率，蛋白質(zhì)在60 min提取過程已接近完全溶出。由于浸提時間越長，能耗越大[22]，故浸提時間選擇60 min為佳。

2.3.4 浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響

在料液比1∶15、浸提pH 11、浸提時間60 min條件下，研究浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 浸提溫度對山蒼子蛋白提取率的影響

由圖5可以看出，當(dāng)浸提溫度為25℃時，山蒼子蛋白提取率為30.09%，當(dāng)浸提溫度升高至35℃時，提取率略微升高，浸提溫度繼續(xù)升高，提取率變化不大，由于浸提溫度過高會使蛋白質(zhì)變性并增加能源消耗，同時會對蛋白結(jié)構(gòu)造成一定影響[23]。綜合考慮，浸提溫度選擇35℃為佳。

2.4 正交試驗優(yōu)化山蒼子蛋白提取工藝條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以浸提pH、浸提溫度、料液比、浸提時間4個因素為變量，山蒼子蛋白提取率為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，以確定堿提山蒼子蛋白最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表2，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表3可以看出，在堿提山蒼子蛋白工藝中，4個因素主次順序為浸提pH>浸提溫度>料液比>浸提時間，最優(yōu)組合為A3B2C2D1，即浸提pH 12、浸提溫度35℃、料液比1∶15、浸提時間60 min。但由于當(dāng)浸提pH為12時，溶液處于過堿狀態(tài)，蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)將易被破壞，故浸提pH選取11，在此條件下提取率為31.03%，提取物中蛋白質(zhì)含量為75%。

2.5 pH對山蒼子蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響(見圖6)

圖6 pH對山蒼子蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖6可見，pH對山蒼子蛋白起泡性具有顯著影響，起泡性整體變化趨勢與山蒼子蛋白溶解度呈現(xiàn)相似趨勢。在等電點(diǎn)pH 4附近，山蒼子蛋白溶解度最低，起泡性也最低，約為5%，隨著pH偏離等電點(diǎn)，山蒼子蛋白可溶部分增多，起泡性顯著升高，當(dāng)pH為10時，起泡性達(dá)130%。泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)相似趨勢，隨著pH偏離等電點(diǎn)，山蒼子蛋白溶解度的增加，使更多的蛋白質(zhì)作為泡沫穩(wěn)定劑吸附在氣泡表面，蛋白質(zhì)分子間相互作用形成較厚的吸附膜，從而增加泡沫穩(wěn)定性[24]。雖然山蒼子蛋白在pH 10時具有最高的起泡性，但此時泡沫穩(wěn)定性并未顯著提升，表明高堿性pH時蛋白結(jié)構(gòu)伸展，使得蛋白吸附速度提高，但同時由于此時靜電斥力增大，故起泡性增大，但泡沫穩(wěn)定能力下降。

2.6 pH對山蒼子蛋白乳化性的影響(見圖7)

圖7 pH對山蒼子蛋白乳化性的影響

由圖7可見，當(dāng)pH為4時，山蒼子蛋白的乳化性最低，可能是由于等電點(diǎn)時溶解性較差，吸附在油-水界面上的蛋白數(shù)量減少，蛋白呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，導(dǎo)致表面活性較低。中性及堿性條件時，蛋白分子靜電斥力增大，蛋白表面帶電荷量增多，有利于避免蛋白的聚集，此時蛋白溶解度較高，較多蛋白分子吸附在兩相界面上，使得乳化性提高[25]。

2.7 持水性

2.7.1 pH對山蒼子蛋白持水性的影響(見圖8)

圖8 pH對山蒼子蛋白持水性的影響

持水性可表征蛋白與水分子結(jié)合形成凝膠的能力。由圖8可見，山蒼子蛋白的持水力在pH 2～10范圍呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在pH 4～6范圍山蒼子蛋白的持水力較低，在偏酸性和偏堿性條件下具有較高的持水力。這可能是因為pH影響了蛋白分子的離子作用和靜電荷數(shù)量，從而影響蛋白分子間的作用力以及蛋白與水分子結(jié)合的能力。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時，蛋白分子靜電斥力增加，使持水性增加[26]。

2.7.2 溫度對山蒼子蛋白持水性的影響(見圖9)

圖9 溫度對山蒼子蛋白持水性的影響

由圖9可見，山蒼子蛋白的持水力隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在30～60℃，山蒼子蛋白的持水力隨著溫度的升高而增大，60℃時達(dá)到最大；超過60℃，隨著溫度繼續(xù)升高，持水力略有下降，這可能與蛋白質(zhì)的熱變性有關(guān)，高溫時蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化，分子之間相互聚集，從而使持水力下降。蛋白質(zhì)適度的熱變性有利于其分子的伸展，從而增加蛋白質(zhì)分子與水作用程度，而過高的溫度會使蛋白質(zhì)熱變性程度升高[27]。同時將山蒼子蛋白持水力與商業(yè)大豆分離蛋白的持水力比較，可發(fā)現(xiàn)山蒼子蛋白持水力與大豆分離蛋白接近，并在溫度低于60℃時持水力略高于大豆分離蛋白。

3 結(jié) 論

對山蒼子核仁中蛋白提取工藝條件進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，得到的最佳工藝條件為：浸提pH 11，料液比1∶15，浸提溫度35℃，浸提時間60 min。在最佳條件下，山蒼子蛋白的提取率為31.03%，提取物中蛋白質(zhì)含量為75%。山蒼子蛋白等電點(diǎn)為4.0，山蒼子蛋白的起泡性、乳化能力、持水能力均在pH偏堿性范圍較高，在等電點(diǎn)附近，山蒼子蛋白溶解性、乳化性及起泡性均較低。山蒼子蛋白持水性與商業(yè)大豆分離蛋白接近，具有較好的功能性質(zhì)。