桂皮醛脂質體制備工藝研究*

高 艷，鄭夢成，杜守穎，白 潔，陸 洋，李鵬躍

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

皮膚光老化是由于皮膚暴露于紫外線下而造成的慢性損傷，可誘發(fā)脂溢性角化病、膠樣粟丘疹、光線性肉芽腫、日光性角化病等一系列增生性病變，嚴重者可能發(fā)生皮膚癌、基底細胞癌等惡性腫瘤[1]，但目前通過臨床研究的有效治療措施較少。0.05%全反式維生素A酸霜是目前惟一被美國FDA批準治療皮膚光老化的產品[2]，但維生素A酸類藥有引起肌肉疼痛，體內中性粒細胞減少等問題[3]。非甾體抗炎類藥物如阿司匹林雖可延緩或減輕紅斑效應及預防治療慢性光損傷[4]，但有增加曬傷細胞形成，誘導皮膚產生紅斑等[5]問題。

桂皮醛是中藥材肉桂揮發(fā)油的主要成分。相關研究表明，桂皮醛對治療皮膚光老化具有一定的作用，可抑制黑素瘤細胞增殖并促進其凋亡[6-7]。在不影響皮膚成纖維細胞正常生長的情況下能抑制UVA誘導的MAPK通路活化，進而抑制MMP-1和MMP-3產生；在體外能抑制二維和三維培養(yǎng)的黑素瘤A375細胞的侵襲能力，抑制二維和三維培養(yǎng)的A375細胞內NF-κB的活化，具有抗黑素瘤的能力[8]。這些藥理活性為皮膚光老化的預防與治療以及黑素瘤的治療提供新的研究方向，因此本研究考慮將桂皮醛應用于皮膚光老化的預防治療中。

但由于桂皮醛分子中存在烯醛結構，在空氣中易被氧化，穩(wěn)定性較差。同時桂皮醛難溶于水，導致臨床上口服吸收較差，生物利用度低，影響其使用與療效?，F(xiàn)有治療皮膚光老化的手段之一則是將藥物作用于表皮與真皮之間，因此采用外用給藥技術，可增強桂皮醛改善皮膚光老化的作用[9]。因此，為改善桂皮醛的生物利用度，提高桂皮醛的穩(wěn)定性，研究嘗試將脂質體技術應用于桂皮醛中，進行桂皮醛脂質體的制備。本文采用薄膜-超聲分散法制備桂皮醛脂質體，采用超濾法對其進行包封率測定，并采用正交法進行處方優(yōu)化篩選。

1 儀器與試劑

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司，SPD-M20A，PDA檢測器，LCSolution色譜工作站）；賽多利斯BT 25S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；KQ5200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司，編號：01C266）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Nano series SZ-100型激光粒度儀（英國馬爾文公司）；Millipore超濾離心管（0.5 mL，30 kDa，上?？￡缮锟萍加邢薰荆?；JEM-1230透射式電子顯微鏡（日本電子株式會社）

桂皮醛對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：H02M6Q1）；桂皮醛提取物（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10054406）；卵磷脂（德國Lipoid公司，批號：579010-1150050-11/903）；膽固醇（美國amresco公司，批號：0786C157）；甲醇（Fisher公司，色譜純）；乙腈（Fisher公司，色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 桂皮醛脂質體的制備 稱取處方量桂皮醛提取物、膽固醇、卵磷脂于250 mL茄形瓶中，加入無水乙醇溶解。置于旋轉蒸發(fā)儀上，50℃水浴，無水乙醇完全回收后，茄形瓶內壁上形成一層乳白色均勻薄膜。加入磷酸鹽緩沖液20 mL，水浴加熱旋轉，均勻混合后，于細胞破碎儀下超聲5 min（超聲5 s，停頓5 s，300 W），得乳白色均勻混懸液，依次過0.8、0.45、0.22μm微孔濾膜，即為桂皮醛脂質體。4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 脂質體中桂皮醛含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 采用Diamosil-C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；流動相乙腈：0.1%磷酸=55∶45；檢測波長290 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL。在此色譜條件下，桂皮醛峰形對稱，分離度良好。且空白脂質體在該處無吸收，說明輔料對其含量測定無影響。測定色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取桂皮醛對照品16.45 mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得到濃度為1 645μg/mL的桂皮醛儲備液，用甲醇分別稀釋為82.25、41.125、32.90、20.56、8.225、3.29μg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取脂質體溶液0.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶解超聲處理30 min，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 線性范圍的考察 按照“2.1.2”項下方法處理對照品溶液，分別得到濃度為82.25、41.125、32.90、20.56、8.225、3.29μg/mL的對照品溶液，在選定的色譜條件下，采用高效液項色譜法（HPLC）分析，測定桂皮醛的峰面積，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程Y=102 744X+50 214，R2=0.999 8，線性范圍為3.29～82.25μg/mL。

圖1 桂皮醛對照品及脂質體色譜圖

2.2.5 精密度、重復性、穩(wěn)定性考察 取32.9μg/mL桂皮醛對照品溶液，連續(xù)HPLC進樣測定6次，精密度的RSD為0.15%，小于2%，表明儀器的精密度良好。精密量取上述脂質體6份，按照“2.1.3”項下方法處理樣品，HPLC進樣測定峰面積，重復性的RSD為1.21%，小于2%，表明實驗的重復性良好。按照“2.1.3”項下方法處理樣品，分別于不同時間（0、2、4、8、12、24 h）HPLC進樣測定峰面積，穩(wěn)定性的RSD為0.35%，小于2%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.2.6 回收率考察 精密量取已知含量的脂質體0.5 mL各9份，置于5 mL棕色量瓶中，分別加入低、中、高濃度的桂皮醛對照品溶液。加入甲醇超聲處理30 min，定容至刻度，搖勻，測定。結果見表1。

由以上結果可知，低、中、高濃度桂皮醛的平均回收率分別為99.76%、100.07%、100.52%，處于95%～105%之間，RSD均小于2%，說明本法具有良好的回收率。

2.3 桂皮醛脂質體包封率測定方法的建立

2.3.1 超濾法測定包封率 取0.5 mL桂皮醛脂質體，超純水定容至5 mL，取0.4 mL置于30 KD超濾管中，4 000 r/min離心5 min，取下層離心液體至10 mL容量瓶中，甲醇洗滌超濾管3次，與上述離心液合并，定容至10 mL。HPLC測得脂質體中游離藥物的含量（C游離）；按2.1.3測定脂質體中桂皮醛的含量（C總）。根據包封率（EE）的計算公式計算樣品中桂皮醛的包封率。

表1 桂皮醛加樣回收率考察

包封率（EE）＝（C總－C游離）/C總×100%

2.3.2 超濾管預飽和次數考察 實驗發(fā)現(xiàn)超濾膜會對桂皮醛產生一定程度的吸附，需要在使用前對超濾膜進行預飽和，以桂皮醛的甲醇溶液對飽和次數進行了考察，結果見表2。

表2 預飽和次數考察

由結果可知，預飽和2次后回收率已符合要求，在95%～105%之間，因此在接下來實驗中，需對超濾管預飽和2次后再進行相關操作。

2.3.3 超濾法方法回收率考察 配制低、中、高3種含量的桂皮醛的甲醇溶液，取0.4 mL置于已飽和的30 KD超濾管中，4 000 r/min離心5 min，取下層離心液體至10 mL容量瓶中，甲醇洗滌超濾管3次，與上述離心液合并，定容至10 mL。測定桂皮醛的含量。每一濃度平行3份，計算回收率。結果見表3。

由上表結果可知，低、中、高不同含量的桂皮醛甲醇溶液經過預飽和的超濾管后，回收率均在95%～105%之間，RSD小于2%，說明已飽和的超濾膜對桂皮醛無吸附作用。

2.3.4 桂皮醛脂質體包封率加樣回收率考察 精密量取空白桂皮醛脂質體0.5 mL，各9份，置于5 mL棕色量瓶中，分別加入不同含量的桂皮醛溶液至容量瓶中，定容至5 mL，搖勻。取0.4 mL置于30 KD超濾管中，4 000 r/min離心5 min，取下層離心液體至10 mL容量瓶中，甲醇洗滌超濾管3次，與上述離心液合并，定容至10 mL。高效液相色譜法（HPLC）測桂皮醛的含量，計算其加樣回收率。結果見表4。

表3 超濾法方法回收率實驗結果（n=3）

表4 脂質體包封率加樣回收率實驗結果（n=3）

由上表結果可知，低、中、高不同含量的桂皮醛溶液加入到空白脂質體中后，回收率均在95%～105%之間，RSD小于2%，說明超濾法可有效分離脂質體中未包封的藥物，可用于脂質體包封率的測定。

2.4 單因素考察篩選處方

2.4.1 膽固醇與卵磷脂質量比例的考察 固定藥脂比為1∶16，即桂皮醛含量10 mg，磷脂與膽固醇總量為160 mg，磷酸鹽緩沖液pH 7.4，水化成膜溫度55℃。設置膽固醇與磷脂的比例為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，按2.3.1分別測定脂質體的包封率及載藥量，每組平行操作兩份，結果見表5。

實驗結果顯示，其余制備條件不變，隨著磷脂膽固醇比例的改變，脂質體的包封率及載藥量有明顯變化（P＜0.05），當膽固醇：磷脂比例在1∶8時，制備的脂質體包封率及載藥量最大。因此，以膽固醇：磷脂質量比為1∶8為基礎，選取不同比例作為后期考察優(yōu)化的條件。

表5 不同比例磷脂與膽固醇處方包封率與載藥量

2.4.2 桂皮醛與輔料質量比例的考察 固定磷脂膽固醇比例為1∶8，即桂皮醛含量10 mg，磷酸鹽緩沖液pH 7.4，水化成膜溫度55℃。設置桂皮醛與膽固醇磷脂的質量比例為1∶8、1∶16、1∶24、1∶32，按2.3.1分別測定脂質體的包封率及載藥量，每組平行操作兩份，結果見表6。

表6 不同藥輔比處方包封率與載藥量

實驗結果顯示，其余制備條件不變，隨著藥輔比的改變，脂質體的包封率及載藥量有明顯變化（P＜0.05）。隨著藥輔比的增加，包封率不斷增大，但隨著藥輔比增高，載藥量也隨之降低。因此，選取不同桂皮醛與輔料的質量比，以綜合評分的方式作為后期考察優(yōu)化的條件。

2.4.3 水化溫度的考察 固定磷脂膽固醇的比例為1∶8，桂皮醛與磷脂膽固醇總量比例為1∶32，即桂皮醛含量10 mg，膽固醇355.55 mg，磷脂2 844.44 mg，磷酸鹽緩沖液pH 7.4，改變水化溫度分別為55℃、60℃、65℃，按2.3.1分別測定脂質體的包封率及載藥量，每組平行操作兩份，結果見表7。

表7 不同水化溫度包封率與載藥量

實驗結果顯示，隨著水化溫度的改變，在相同的制備條件，55、60、65℃不同的水化溫度下，桂皮醛脂質體包封率及載藥量無明顯變化（P＞0.05）?；谫Y源節(jié)約的角度考慮，選定55℃作為水化溫度，后期不列入正交考察處方范圍內。

2.4.4 磷酸鹽緩沖液pH值的考察 固定磷脂膽固醇的比例為1∶8，桂皮醛與磷脂膽固醇總量比例為1∶32，即桂皮醛含量10 mg，膽固醇355.55 mg，磷脂2 844.44 mg，水化溫度為55℃，改變磷酸鹽緩沖液pH值分別為6.6、7.0、7.4，按2.3.1分別測定脂質體的包封率及載藥量，每組平行操作兩份，結果見表8。

表8 不同p H磷酸鹽緩沖液包封率與載藥量

實驗結果顯示，相同的制備條件下，隨著磷酸鹽緩沖液pH的改變，脂質體的包封率有明顯變化（P＜0.05），pH值為7.0時，包封率和載藥量相對較大，因此，以pH7.0為基礎，選取不同pH的磷酸鹽緩沖液作為后期考察優(yōu)化的條件。

2.5 正交法優(yōu)化處方

2.5.1 正交實驗 通過單因素考察，確定主要影響制備的因素為桂皮醛與輔料的比例（A）、膽固醇與卵磷脂的比例（B）、磷酸鹽緩沖液的pH值（C），以桂皮醛脂質體的包封率及載藥量為參考指標，每個因素設計三個水平，選用L9（34）正交表，進行正交試驗。正交結果見表9-11。

表9 因素水平表

表10 正交試驗結果L 9（34）

表11 方差分析表

以包封率與載藥量權重各50%進行綜合評分。綜合評分的公式為Y=Ai/Amax X 50%+=Bi/Bmax X 50%（Y為綜合評分，A為包封率，B為載藥量）。由正交試驗結果顯示，極差的大小順序為A>B>C，桂皮醛脂質體制備工藝中影響包封率的主次因素順序為A>B>C，即桂皮醛與輔料的比例影響最大，膽固醇與磷脂質量比例次之，磷酸鹽緩沖液pH最小。經方差分析，桂皮醛與輔料的比例（A）、膽固醇與卵磷脂的比例（B）對包封率有統(tǒng)計學意義，磷酸鹽緩沖液的pH值（C），對包封率有統(tǒng)計學意義。

以綜合評分為指標，最佳處方工藝為A1B2C2，為正交表中第2號試驗。即桂皮醛與輔料質量為1∶12，膽固醇與磷脂質量比為1∶8，磷酸鹽緩沖液pH為7.0，水化溫度55℃下，為桂皮醛脂質體制備的最佳工藝。

2.5.2 正交驗證實驗 按上述最佳處方采用薄膜-超聲分散法制備3批桂皮醛脂質體，測定包封率分別為82.16%、81.04%、82.38%；載藥量為5.58%、5.18%、5.57%。表明3批桂皮醛脂質體的包封率無顯著性差異，制備工藝重現(xiàn)性良好。

2.6 桂皮醛的表征及穩(wěn)定性試驗

2.6.1 脂質體粒徑測定 制備桂皮醛脂質體各3份，用純凈水稀釋到適當倍數，用激光粒度分析儀測定其粒徑分布情況。結果見表12，圖2。脂質體平均粒徑為81.43 nm，多分散性系數為0.209，分布均勻，符合脂質體的制備要求。

表12 桂皮醛脂質體粒徑測定結果

2.6.2 桂皮醛脂質體形態(tài)觀察 肉眼觀察桂皮醛脂質體為均一乳白色膠體溶液，稀釋可見乳光；采用透射電鏡觀察其形態(tài)，結果見圖3。脂質體形態(tài)單一穩(wěn)定。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取2.6.3中驗證試驗中制備的桂皮醛脂質體，4℃保存，觀察脂質體溶液依舊透明澄清，無明顯沉淀出現(xiàn)，14 d后測定其滲漏率。結果如下表13。桂皮醛脂質體溶液的滲漏率均小于2%，所制備的脂質體較為穩(wěn)定。

圖2 桂皮醛脂質體粒徑分布圖

圖3 桂皮醛脂質體60 000x透射電鏡照片

表13 桂皮醛脂質體14 d滲漏率

3 討論

在脂質體處方中，卵磷脂與膽固醇能夠起到膜流動性調節(jié)劑的作用，卵磷脂及膽固醇比例的改變對成膜效果有著重要的影響；成膜后加入水化溶液在一定的溫度下可形成脂質體。因此單因素試驗中考察了膽脂比、藥輔比、水化成膜溫度、磷酸鹽緩沖液pH，實驗結果表明，除水化溫度外，隨著膽脂比、藥輔比、磷酸鹽緩沖液pH的改變，桂皮醛脂質體的包封率及載藥量均有較為顯著的變化，因此后期將其列入進一步優(yōu)化的水平。

本實驗對超濾管的預飽和次數進行了考察；對超濾后的液體通過加甲醇洗滌、定容的方式進行處理，保證了游離藥物測定的準確性。脂溶性藥物難溶于水，易溶于有機溶劑，但有機溶劑的加入會造成脂質體的破乳。因此超濾法測定脂溶性藥物時還存在較難考察回收率的問題。本實驗通過采用微量注射器進樣注入微量高濃度桂皮醛甲醇溶液避免了對脂質體造成破乳。通過對桂皮醛脂質體包封率的測定，證明可采用超濾法測定脂溶性藥物包封率。實驗中制備的脂質體粒徑為81.43nm，可攜帶藥物透過皮膚角質層屏障，在皮下形成藥物儲庫。因此，桂皮醛脂質體對皮膚光老化的治療具有一定的臨床意義。作為一種外用劑型，桂皮醛脂質體的具體給藥形式，經皮滲透行為及長期穩(wěn)定性等都會直接影響療效，實驗后期也將繼續(xù)完善此部分內容。