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    食品中黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法研究

    2019-04-26 01:22:28張宏博靳志敏高智慧鄭玉山
    食品安全導(dǎo)刊 2019年2期
    關(guān)鍵詞:致癌性檢測(cè)方法毒性

    張宏博 靳志敏 高智慧 鄭玉山

    摘 要:黃曲霉毒素(AF)是廣泛存在于自然界中的真菌毒素,而在所有的真菌毒素中,AFB1的毒性、致癌性較大,其能阻止蛋白、酶和凝血因子合成,又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產(chǎn)物的合成,從而引起免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷。AFB1的檢測(cè)方法大致分為化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法三大類(lèi),本文主要對(duì)運(yùn)用較為廣泛的TLC(薄層層析)、HPLC(高效液相色譜)、GICA(膠體金標(biāo)免疫層析分析法)、ELISA(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)方法進(jìn)行論述。

    關(guān)鍵詞:黃曲霉毒素? 毒性? 致癌性? 檢測(cè)方法

    1 黃曲霉毒素概況及其發(fā)病機(jī)理

    黃曲霉毒素(AF)主要成分是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的有毒性的次生代謝產(chǎn)物,屬于真菌毒素,廣泛存在于自然界中[1,2]。黃曲霉毒素由大約18種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的衍生物組成,包括B和G兩大類(lèi),植物性食物中產(chǎn)生B1、B2、G1和G2[3],而乳或乳制品(包括乳酪、奶粉等)中產(chǎn)生M1、M2。黃曲霉毒素B1在植物性食物衍生組中毒性最強(qiáng),其慢性毒性甚至可誘發(fā)肝癌。

    AF需要在機(jī)體內(nèi)代謝活化才能表現(xiàn)出毒性。首先,細(xì)胞內(nèi)的多功能氧化酶將AF催化成環(huán)氧化物;然后,環(huán)氧化物與大分子反應(yīng)生成DNA、RNA、蛋白質(zhì)和類(lèi)脂的結(jié)合物,并表現(xiàn)出兩種毒性——急性毒性和慢性毒性,分別表現(xiàn)為AF與蛋白質(zhì)(包括酶)、類(lèi)脂的反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,與核酸的反應(yīng)可導(dǎo)致突變。研究表明,在所有真菌毒素中,AFB1的毒性、致癌性最大——能阻止蛋白、酶和凝血因子合成,又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產(chǎn)物的合成,從而導(dǎo)致免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷[4]。

    AFB1在動(dòng)物體中的急性毒性如表1所示,其毒性因動(dòng)物年齡、種類(lèi)、性別而異[5]。一般來(lái)說(shuō),幼年動(dòng)物對(duì)AFB1的敏感性要大于成年動(dòng)物,雄性動(dòng)物的敏感性要大于雌性動(dòng)物。研究表明,當(dāng)豬飼料中AFB1的含量達(dá)到810ppm時(shí),飼料的轉(zhuǎn)化率下降,豬的體重也明顯下降,甚至?xí)霈F(xiàn)死亡,解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)退行性變化,肝細(xì)胞大面積壞死。AF除了會(huì)對(duì)大鼠引起肝癌外,還會(huì)使大鼠患上胃癌、結(jié)腸癌和腎臟上皮癌[6]。

    人體攝入被AF污染的食物后經(jīng)消化道吸收,其大部分積累在肝臟,少部分分布在腎臟、血液和肌肉中,在機(jī)體內(nèi)通過(guò)羥基化、去甲基化和環(huán)氧化等作用形成代謝產(chǎn)物使機(jī)體致癌、致突變。研究表明,AF的LD50(半數(shù)動(dòng)物致死量)為0.249mg/kg,毒性比氰化鉀高10倍[7]。AFB1在人體內(nèi)的危害表現(xiàn)為急性毒性和慢性毒性,急性毒性在人體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、膽管上皮細(xì)胞增生、肝脂肪浸潤(rùn)及肝出血等[8],前期癥狀為發(fā)燒、嘔吐、黃疸,繼而出現(xiàn)腹水和下肢浮腫,最終可導(dǎo)致死亡。AFB1是一種能導(dǎo)致人體遺傳物質(zhì)發(fā)生變化的致突變化合物,其在人體的代謝產(chǎn)物有致突變作用,包括AFB1-2,3-環(huán)氧化物、AFM1和AFP1等,其中AFB1-2,3-環(huán)氧化物的第2個(gè)碳與DNA的鳥(niǎo)嘌呤酮基結(jié)合形成AFB1-DNA加合物,去嘌呤反應(yīng)通過(guò)形成AFB1-N7-鳥(niǎo)嘌呤,使DNA分子產(chǎn)生無(wú)嘌呤位置的缺口,從而造成DNA損傷,進(jìn)而可能導(dǎo)致癌變。致癌性表現(xiàn)為AFB1可引起細(xì)胞錯(cuò)誤地修復(fù)DNA,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA誘變,并進(jìn)一步抑制DNA和RNA的合成,最終抑制蛋白質(zhì)的合成及基因變化積累[9,10]。目前,科學(xué)家已證實(shí)p53基因是癌癥的抑制基因,很多人可能在幼年時(shí)就受到AFB1的攻擊,加之人體內(nèi)特定基因的缺失或變異引起p53基因突變,最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生癌變[11]。

    由于A(yíng)FB1具有危害性和廣泛性,人們需要有效的檢測(cè)方法測(cè)定其在食品中的含量,確保對(duì)人和家畜的傷害降到最低。目前檢測(cè)AFB1的方法很多,但主要分為三大類(lèi):化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法[12-14],其中有4種方法的運(yùn)用較為廣泛,即TLC(薄層層析)、HPLC(高效液相色譜)、GICA(膠體金標(biāo)免疫層析分析法)、ELISA(酶聯(lián)免疫法)。

    2 食品中AFB1的幾種檢測(cè)方法

    2.1 薄層層析法(TLC)

    AF是低分子量極性化合物,它的特點(diǎn)是可以吸收紫外光,利用這一特點(diǎn)衍生了多種測(cè)定AF的方法,而薄層層析方法是最早被運(yùn)用的方法。薄層層析法(TLC)同時(shí)具有定性和定量的分析功能,所以被美國(guó)官方確定為標(biāo)準(zhǔn)方法,我國(guó)也在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中將其確立為仲裁法[15]。TLC的原理是利用AFB1在365nm紫外波長(zhǎng)下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光的特點(diǎn),再經(jīng)過(guò)固相層分離后,對(duì)其熒光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定,并且與標(biāo)準(zhǔn)液相比,最終得出結(jié)果。這種方法不需要專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備,成本低,實(shí)驗(yàn)室大都能完成對(duì)AF的測(cè)定。但是,最原始的薄層分析由于分辨率不穩(wěn)定,受周?chē)蛩氐挠绊懞艽?,檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定,差異性較大。同時(shí),該方法的工作量比較復(fù)雜,耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),且在做定量分析時(shí)精確度較低?,F(xiàn)如今,隨著科技的迅速發(fā)展,出現(xiàn)了很多固相吸附材料,可以使薄層層析的準(zhǔn)確度得到提升,其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量。張慧麗等通過(guò)用黃曲霉菌株接種18種花生仁,利用半定量薄層層析法和精確定量高效液相色譜法檢測(cè)到的AF質(zhì)量濃度確定花生的抗AF合成的能力,鑒定出2個(gè)高抗黃曲霉感染和AF質(zhì)量濃度低的花生品種[16]。

    2.2 高效液相色譜(HPLC)

    1986年,AOAC International首次將高效液相色譜法(HPLC)作為檢測(cè)乳液中AFM1及AFM2公認(rèn)的方法[17],也是國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為檢測(cè)AF最權(quán)威的一種方法,其具有分析自動(dòng)化的潛力,且具備靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[18]。但是,HPLC對(duì)樣品的純度要求很高,必要時(shí)需將原料進(jìn)行衍生才能使用這種方法。經(jīng)長(zhǎng)期研究實(shí)踐,研究人員總結(jié)出一些使用該方法的技巧。AF的熒光特性受流動(dòng)相中的液體影響較大,只能檢測(cè)到1~2種AF,有的甚至?xí)l(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象,所以在測(cè)定時(shí)要同時(shí)運(yùn)用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器才能將試樣中的AF檢測(cè)完全。此外,國(guó)內(nèi)外學(xué)者也對(duì)高效液相色譜法測(cè)定AF進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。陸勤佳等人基于高效液相色譜熒光法設(shè)計(jì)并完成了一套由分離系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、熒光檢測(cè)器、主控板和人機(jī)交互界面組成的AF檢測(cè)系統(tǒng),并且經(jīng)過(guò)測(cè)試,表明該AF檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性——結(jié)構(gòu)緊湊、檢測(cè)速度快且靈敏度高,能用于A(yíng)F的實(shí)際檢測(cè)[19]。王勇建立AFB1的柱前衍生-高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法,該方法具有良好的準(zhǔn)確性、靈敏性和重復(fù)性,可對(duì)組織樣品中AFB1殘留量進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析,為AFB1在食品中的快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)[20]。Beaver R、Klaus R等研究發(fā)現(xiàn),在柱后衍生時(shí)向其中加入碘,會(huì)增強(qiáng)AFB1的熒光度——是之前的25倍,該方法已經(jīng)被運(yùn)用到花生制品AFB1的含量檢測(cè)中[21,22];該方法需要使用的儀器非常昂貴,一般在進(jìn)出口檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用。羅朝權(quán)等為建立一種快速檢測(cè)動(dòng)物類(lèi)藥材污染AFB1(AFB1)和AFG1(AFG1)的液質(zhì)聯(lián)用法,并用于水蛭等6種動(dòng)物類(lèi)中藥材污染情況的分析,結(jié)果表明,土鱉蟲(chóng)等動(dòng)物類(lèi)藥材受AF污染的情況較為嚴(yán)重[23]。

    2.3 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

    酶聯(lián)免疫法在1971年以后開(kāi)始被運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)中,成為檢測(cè)食品中AFB1最簡(jiǎn)單、方便的方法之一。ELISA的原理是利用抗原與抗體之間的高度特異性和酶的高效催化性,抗原或抗體與某種載體結(jié)合,在檢測(cè)時(shí)樣品中的酶標(biāo)抗原抗體與載體上的抗原或抗體會(huì)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生抗原抗體的復(fù)合物,通過(guò)添加酶使產(chǎn)生的物質(zhì)快速顯現(xiàn)顏色,且AF的含量越高,底物的顏色越淺,從而達(dá)到檢測(cè)的目的,是一種可以定性定量分析的方法[24,25]。該方法的關(guān)鍵點(diǎn)首先是抗原或抗體在檢測(cè)的過(guò)程中要一直保持活性,并且還可以與載體相結(jié)合;其次是酶在檢測(cè)的過(guò)程中要始終保持活性,即使是與抗原或抗體結(jié)合后,仍能發(fā)揮出酶的催化作用,但這種酶容易受溫度等多種因素的影響,所以一般將其在低溫下保存。常用的ELISA有直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、抑制性測(cè)定法等[26,27]。胡竹行等研究了酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大曲中AFB1的提取條件,結(jié)果表明,在甲醇濃度為55%(v/v)、提取時(shí)間為25min、功率為200W時(shí),其提取率明顯高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]。當(dāng)前,為了更加方便而利用ELISA研發(fā)出酶聯(lián)免疫法分析試紙盒,并且已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn),為人們的生活提供便利。酶聯(lián)免疫法分析試紙盒沒(méi)有改變?cè)?,且檢測(cè)的準(zhǔn)確性十分可靠,該方法目前被廣泛用于飼料原料中檢測(cè)AFB1的含量。李江等用酶聯(lián)免疫法對(duì)食用油中AFB1的測(cè)定結(jié)果與液相法比較,符合率高,能夠用于食用油中AFB1的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)[29]。

    2.4 膠體金標(biāo)免疫層析分析法(GICA)

    納米金是直徑1~100nm的金微小粒子,是一種帶負(fù)電的疏水膠體。膠體金標(biāo)免疫層析分析法就是利用納米金作為標(biāo)記底物,所需檢測(cè)時(shí)間較短,可直接讀取檢測(cè)數(shù)值,且該方法不需要對(duì)試樣進(jìn)行分離提純處理,也不用對(duì)檢測(cè)溶劑做處理,操作起來(lái)簡(jiǎn)便且高效[30],是目前最簡(jiǎn)單、最快速的檢測(cè)方法之一。GICA會(huì)使試樣中的AF與偶聯(lián)膠體金的抗AF抗體相結(jié)合,無(wú)論是結(jié)合的還是非結(jié)合的抗體都會(huì)沿著膜的移動(dòng),通過(guò)固定化的真菌毒素組成的檢測(cè)線(xiàn),它將結(jié)合游離的抗體,以形成可見(jiàn)的線(xiàn),以此來(lái)表示AF的污染低于試驗(yàn)的閾值[31]。人們對(duì)于納米金的研究已經(jīng)有很長(zhǎng)的時(shí)間,并在多個(gè)領(lǐng)域得到運(yùn)用。宋青龍等用膠體金免疫層析技術(shù),結(jié)合膠體金定量讀數(shù)儀研制出一種檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好,樣品檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)誤差在20%以?xún)?nèi),快速定量檢測(cè)谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒[32]。劉曉玥等通過(guò)用膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)飼料樣品的檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明,膠體金免疫層析試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法相符率可達(dá)95%以上,說(shuō)明該方法操作簡(jiǎn)單、快速、方便,可以應(yīng)用于谷物及飼料產(chǎn)品AFB1現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[33]。

    3 小結(jié)

    AF是廣泛存在于自然界中的真菌毒素,運(yùn)用較為廣泛的檢測(cè)方法有4種——薄層層析法是最早被運(yùn)用的方法,該方法同時(shí)具有定性和定量的分析功能,但隨著科技的發(fā)展迅速,如今出現(xiàn)了很多固相吸附材料,使薄層層析的準(zhǔn)確度也隨之上升,其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量;高效液相色譜法對(duì)樣品的純度要求很高,但具有分析自動(dòng)化的潛力,以及靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn);酶聯(lián)免疫法的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便及無(wú)污染;而在熒光素、酶、同位素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后,納米金已經(jīng)成為的一種新型標(biāo)記技術(shù)[34]。

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