四環(huán)素類藥物時間分辨熒光層析檢測試紙條的研制

萬宇平 崔海峰 王兆芹 宋灝 叢倩千

摘 要：本試驗建立了一種檢測四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析技術(shù)，并在動物源性食品中對其檢測性能進行了研究。實驗結(jié)果顯示，對豬肉、雞肉等動物組織樣品中四環(huán)素類藥物的檢測限為：四環(huán)素30μg/kg、金霉素60μg/kg、土霉素40μg/kg、強力霉素80μg/kg;對100ppb的磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物無交叉反應，特異性較好;變異系數(shù)小于6%，精密度高;試紙條對高、低溫不敏感，穩(wěn)定性強。

關(guān)鍵詞：四環(huán)素類藥物? ?時間分辨熒光免疫層析技術(shù)? ?快速檢測

四環(huán)素類藥物（TCs）主要由放線菌屬產(chǎn)生，是氫化駢四苯環(huán)衍生物，具有廣譜高效的殺菌抗生功效，對大部分的革蘭氏陰性和陽性菌及少數(shù)酵母有抑制效果，可與大多數(shù)藥物或飼料添加劑混用，現(xiàn)已被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中[1]。但是，四環(huán)素類藥物在使用過程中存在著長期濫用的情況，殘留在動物源性食品中的四環(huán)素類藥物經(jīng)過人們的飲食轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，其在體內(nèi)的消化分解物會抑制蛋白質(zhì)的合成而導致含氮代謝物增加，從而加大腎臟的工作負擔，容易引起腎小管壞死，甚至會因腎功能衰竭而死亡[2]。同時，四環(huán)素類藥物在人體內(nèi)的累積容易引起惡心、嘔吐、食道潰瘍[3]、骨生長暫時性抑制及過敏反應，肝功能障礙者甚至會出現(xiàn)休克、尿毒癥[4]等癥狀，嚴重威脅著人們的身體健康，為此世界各國對TCs殘留的檢測十分關(guān)注。我國規(guī)定，牛奶中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留限量為100μg/L;歐盟第675/92號令中初步規(guī)定，在雞肉及牛奶中的四環(huán)素類藥物含量不得超過100μg/kg，在腎臟、肝臟及雞蛋中的含量分別不得超過600μg/kg、300μg/kg、200μg/kg;日本《肯定列表制度》規(guī)定，奶和雞蛋中四環(huán)素類化合物的總量分別不得超過100ng/mL和400ng/mg[5]。

現(xiàn)階段，國內(nèi)外主要利用高效液相色譜法、毛細管電泳法、微生物法、酶聯(lián)免疫法、電化學分析等對四環(huán)素類藥物進行定性和定量檢測[6-13]。上述各種方法曾在不同時期得到廣泛應用，也各自存在著不同于其他方法的優(yōu)勢與劣勢。具體而言，色譜法需要價格昂貴的大型儀器設備，步驟繁瑣、耗時且對操作人員的專業(yè)性要求較高，不適用于基層企事業(yè)單位的大通量快速篩查檢測;酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條具有檢測速度快、價格便宜、操作簡單等優(yōu)點，但其準確性和重復性較差，基質(zhì)效應明顯，無法實現(xiàn)定量檢測，且顏色單一，背景干擾大，容易造成假陽性或假陰性的結(jié)果。因此，亟需開發(fā)一種簡單快速、準確度高的檢測方法——時間分辨熒光免疫層析檢測方法恰好可以滿足此類需求。本實驗研發(fā)了一種檢測四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析試紙條，并在食源性動物食品的檢測中進行了應用。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗耗材

PVC板，購于上海金標生物科技有限公司;時間分辨熒光微球，購于蘇州為度生物技術(shù)有限公司;吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊，購于普利來基因技術(shù)公司;四環(huán)素類藥物殘留膠體金檢測試紙條，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制。

1.1.2 試劑

四環(huán)素類藥物、各種交叉反應藥物、牛血清白蛋白、卵清蛋白，購自Sigma公司;分泌四環(huán)素類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株，北京勤邦生物技術(shù)有限公司制備;其他常規(guī)化學試劑均購自國藥集團。

1.2 儀器與設備

時間分辨熒光免疫分析儀和旋渦混勻器，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自有;Milli-Q Reference純水儀，購自Millipore公司;2000SBL電子天平，購自美國setm公司;冷凍干燥機，購自Imagene公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光微球標記四環(huán)素類藥物單克隆抗體的制備

取市售的內(nèi)部包埋熒光染料、表面修飾有羧基官能團的微球懸液100μL混懸于900μL、pH5.5～6.5、0.05mol/L的2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）活化緩沖液中，于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸微球于1mL活化緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入適量活化劑，混勻后室溫震蕩活化10min。將上述混懸液于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于pH7.5～8.5、0.05mol/L的硼酸鹽偶聯(lián)緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入10～20μL四環(huán)素類藥物單克隆抗體溶液（蛋白濃度為1mg/mL），混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120min。獲得混懸液于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于0.1～0.4mol/L伯胺（鹽酸羥胺、乙醇胺或氨基乙醇）、1%～10%BSA且pH7.4的PB封閉緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后室溫震蕩封閉30min，然后于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于0.01%NaN3、0.1%BSA且pH7.4的PB貯存緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后于4℃避光保存。

1.3.2 試紙條的制備

①硝酸纖維素（NC）膜的制備

用0.05mol/L、pH7.2的PBS緩沖液將四環(huán)素類藥物半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到100μg/mL，用Isoflow點膜儀將其噴涂于NC膜上的檢測區(qū)（T），噴膜量為1.0μL/cm。用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液將羊抗鼠抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點膜儀將其噴涂于NC膜上的質(zhì)控區(qū)（C），噴膜量為1.0μL/cm。將制備好的NC膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

②樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白（體積分數(shù)）、pH7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液浸泡2h，置于37℃下烘干2h，備用。

③試紙條的組裝

將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊從左至右依次搭接粘貼固定在底板上，樣品吸收墊的末端與硝酸纖維素膜的始端相連，硝酸纖維素膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊，然后用機器切成寬3.96mm的小條，裝在特制的塑料制卡中，形成試紙卡。

將試紙卡與微孔試劑組裝成四環(huán)素類藥物時間分辨熒光免疫層析試紙條，在2～8℃下陰涼避光干燥保存，有效期為12個月。

1.3.3 樣品前處理

準確稱取1g±0.01g組織樣品至10mL離心管中，加入3mL樣本提取液，渦動2min充分混勻后，3000r/min離心5min后取上清（若上層有漂浮物則撥開取上清）待檢。

1.3.4 檢測過程

用微量移液器準確吸取100μL待檢樣品溶液于微孔中，小心抽吸至充分與微孔中試劑混勻，室溫（20～25℃）作用3min;吸取孔內(nèi)混合液全部量（約100μL）垂直滴加于試紙卡加樣孔（S孔）中，液體流動時開始計時，室溫反應5min;用時間分辨熒光免疫分析儀或紫外光下肉眼判讀結(jié)果。

1.3.5 檢測結(jié)果分析

陰性（-）：若熒光檢測儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陰性，或紫外燈下肉眼觀察T線亮度比C線亮度亮一半以上，則表示樣本中不含有四環(huán)素類藥物或其濃度低于檢測限。

陽性（+）：若熒光檢測儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陽性，或紫外燈下肉眼觀察T線亮度比C線亮度暗一半以上，則表示樣本中四環(huán)素類藥物濃度等于或高于檢測限。

無效：若質(zhì)控區(qū)未檢出熒光信號強度，表明操作過程不正確或試紙卡已失效。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗

向豬肉組織中分別加入1/2、1、2倍檢測限濃度的四環(huán)素類藥物，以未加入四環(huán)素類藥物的豬肉組織為空白對照，每組檢測10次。

同一添加濃度下，平行檢測樣的檢測結(jié)果相同，同時檢測線亮度保持一致。通過熒光檢測儀對T、C線的亮度進行讀數(shù)，計算試紙條的變異系數(shù)小于6%，說明本試驗研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條檢測性能穩(wěn)定，精密度高。

2.2 檢測限試驗

向空白豬肉、雞肉樣品中分別添加四環(huán)素類藥物標準品至終濃度為：四環(huán)素15、30、45、60μg/kg，金霉素30、60、90、120μg/kg，土霉素20、40、60、80μg/kg，強力霉素40、80、120、160μg/kg，分別以未添加四環(huán)素類藥物的豬肉、雞肉組織為空白對照，用時間分辨熒光免疫層析試紙條進行檢測驗證。

隨著四環(huán)素類藥物濃度的增加，試紙條檢測結(jié)果陰性越明顯。當豬肉組織和雞肉組織中四環(huán)素類藥物的添加量為1倍，即四環(huán)素為30μg/kg、金霉素為60μg/kg、土霉素為40μg/kg、強力霉素為80μg/kg時，T線亮度為C線亮度的一半左右，結(jié)合讀數(shù)儀的檢測結(jié)果可以進一步印證，本試驗研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條對四環(huán)素、金霉素、土霉素和強力霉素的檢測限分別為30μg/kg、60μg/kg、40μg/kg、80μg/kg。

2.3 特異性試驗

分別向豬肉組織中添加30μg/kg四環(huán)素（TC）、100μg/kg磺胺二甲基嘧啶（SM2）、恩諾沙星（ENR）、氯霉素（CAP），以未添加任何藥物的豬肉組織為空白對照，每個樣品做2次平行試驗。

當向檢測樣中添加30μg/kg四環(huán)素時，試紙條檢測結(jié)果為陽性，而添加100μg/kg磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物的檢測樣品檢測結(jié)果均為陰性，即本試紙條對磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物無交叉反應，特異性好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

將試紙條分別置于4℃和37℃下14d與28d，相同情況下檢測加入30μg/kg四環(huán)素的豬肉組織和雞肉組織樣品中，以未經(jīng)過處理的試紙條檢測值為空白對照，每個樣品做3次平行試驗，分別采用肉眼判斷和讀數(shù)儀對檢測結(jié)果進行測定，用于檢測四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析試紙條穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，本試驗研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條經(jīng)高、低溫處理后對四環(huán)素類藥物的檢測靈敏度沒有發(fā)生顯著變化，表明試紙條穩(wěn)定性較強。

2.5 與其他檢測方法的對比

分別用勤邦公司的四環(huán)素類藥物檢測膠體金試紙條、時間分辨熒光試紙條和儀器方法測定添加不同濃度四環(huán)素類藥物的豬肉組織，儀器方法參考GB/T 21317-2007 《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》（本方法對四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素檢測限均為50μg/kg），檢測結(jié)果如表2所示。

表2的檢測結(jié)果顯示，膠體金試紙條對四環(huán)素類藥物的檢測限最低，時間分辨熒光試紙條次之，但均高于儀器檢測法，均符合我國、歐盟和日本對四環(huán)素類藥物殘留的相關(guān)規(guī)定。

3 討論

本試驗成功開發(fā)了一種動物源食品中四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條，采用本試紙條對不同動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測的精密度、檢測限、特異性和穩(wěn)定性等性能指標進行了探討，同時將本試驗研發(fā)的檢測方法同已有的膠體金和儀器檢測方法進行了比較，結(jié)果顯示，本試驗研發(fā)的試紙條檢測限高于膠體金、低于儀器檢測法。但是，同膠體金試紙條相比，本試驗研發(fā)的四環(huán)素類藥物時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條制備過程中需要的原材料少，尤其是對抗原和抗體的需求量遠少于膠體金試紙條，制作成本低。此外，由于本試紙條采用熒光微球模式，其染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強而穩(wěn)定，檢測結(jié)果不受豬肉、雞肉等組織檢測樣中雜質(zhì)的影響，有效提高了檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。

綜上，本試驗研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時間分辨熒光免疫層析快速檢測試紙條可用于四環(huán)素類多種藥物的同時檢測，其準確性和可靠性均可滿足我國、歐盟和日本對四環(huán)素類藥物的檢測技術(shù)的要求。同時，該方法具有檢測靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性好、生成成本低等優(yōu)點，可用于不同動物食源性食品中四環(huán)素類藥物的快速檢測分析，應用前景廣闊。

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