HPLC法同時測定不同栽培區(qū)域滁菊中8種成分含量

孫婷婷， 魏雅平， 程 紅， 馮 慧， 王 祥， 褚天亮， 葉明君， 俞 浩

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

滁菊(Dendranthemamorifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju)為菊科植物菊的干燥頭狀花序，滁菊因栽培歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)良而馳名全國，其藥用價值位列四大白菊之首，為著名道地藥材[1]。當前，滁菊產(chǎn)業(yè)已成為滁州市地方支柱產(chǎn)業(yè)，對帶動當?shù)剞r(nóng)民增收致富有重大意義?，F(xiàn)代研究表明，滁菊富含黃酮[2]、酚酸[3]、揮發(fā)油[4]、氨基酸和微量元素等多種成分[5]，具有抗氧化[6]、抗病毒[7]、鎮(zhèn)痛[8]、降壓[9]、保護大鼠腦缺血再灌注損傷[10]等多種功能。本試驗利用HPLC法同時測定不同栽培區(qū)域中滁菊中綠原酸[11]、木犀草苷[12]、異綠原酸A、異綠原酸C[13]、黃芩苷[14]、槲皮素[15]、木犀草素[16]、芹菜素[17]等8 種成分的濃度，以期為滁菊藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高效液相色譜儀(日本島津有限公司)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵(鄭州英峪予華儀器有限公司)；CP225D準微量天平(德國賽多利斯公司)；DHG-9101-2SA型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)；TZ520130204離心機(湖南易達京華儀器有限公司)。

滁菊藥材樣品分別采自滁州市全椒縣復興鄉(xiāng)復興村、周崗鄉(xiāng)大莊村、滁州市南譙區(qū)城郊鄉(xiāng)城西村中郢、南譙區(qū)施集鎮(zhèn)明張村、南譙區(qū)大柳鎮(zhèn)廣衛(wèi)村、中國滁州菊花博覽園，及安徽科技學院中藥科技園等7個不同栽培區(qū)域中。綠原酸(含量≥98%，批號：wkq16052705),黃芩苷(含量≥98%，批號：wkq16070503),木犀草素(含量≥98%，批號：wkq16051201)均購于四川省維克奇生物科技有限公司；槲皮素(含量≥98.5%，批號：J1226035)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜素(含量≥98.20%，批號：15032610)，購于中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(含量≥98%，批號：Y24N8Y49009),木犀草苷(HPLC≥98%，批號：Y05D8H49919),異綠原酸C(含量≥98%，批號：P25J6F1794)購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇購于安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；乙?色譜純)購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；其他試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(表1)；流速：0.8 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 混合標準品溶液的制備 精密稱定綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素標準品各1.0 mg，經(jīng)70%甲醇溶解后，定容于10 mL容量瓶中，超聲20 min，得出0.10 mg/mL的標準品儲備液。分別吸取不同體積的溶液制成混合標準品溶液，于4 ℃冰箱保存。各標準品濃度見表2。

表2 混合標準品各成分濃度

1.2.3 滁菊檢測樣品溶液的制備 取不同栽培區(qū)域滁菊，干燥后粉碎，過一號篩，得滁菊粗粉。精密稱定滁菊粗粉0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定重量。超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)40 min，靜置冷卻后再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，置4 ℃冰箱保存待測。檢測時用0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 線性關系考察 取1.2.2節(jié)下配制的混合標準品溶液，分別進樣3、6、9、12、15 μL，按1.2.1節(jié)下方法測定，以峰面積(Y)為縱坐標，標準品質(zhì)量(X)為橫坐標，繪制各標準品標準曲線。

1.3.2 專屬性考察 分別取1.2.2節(jié)下混合標準品溶液和1.2.3節(jié)下滁菊樣品溶液10 μL進樣，測定標準品溶液各成分保留時間、滁菊樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留時間及各峰分離程度(圖1)。

1.3.3 精密度測定 取1.2.2節(jié)下混合標準品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.1節(jié)下色譜條件進行分析，連續(xù)重復進樣6 次，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素吸收峰峰面積積分值，計算RSD值分別為1.91%、1.78%、2.56%、0.97%、0.67%、0.64%、1.09%、2.40%。

1.3.4 穩(wěn)定性測定 取1.2.3節(jié)下中國滁州菊花博覽園檢測樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的峰面積，計算RSD值分別為0.31%、0.61%、1.64%、0.66%、1.66%、0.23%、0.29%、2.10%。

1.3.5 重復性試驗 取中國滁州菊花博覽園樣品6份，精密稱定0.25 g，按1.2.3節(jié)下制備檢測樣品溶液，按1.2.1節(jié)下色譜條件進樣，以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積，計算RSD值分別為1.20%，1.94%，0.52%，2.01%，1.70%，1.26%，1.16%，1.31%。

1.3.6 加樣回收率測定 精密稱定已知含量的滁菊藥材粉末6 份，每份約0.125 g，分別精密加入已知量混合標準品溶液，按1.2.3節(jié)下操作制備檢測樣品溶液，進樣10 μL，計算平均加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察結(jié)果

建立上述HPLC檢測方法，同時測定混合標準品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分峰面積，分別建立8條線性關系(表3)。在相應線性范圍內(nèi)，其相關系數(shù)均在0.999以上，結(jié)果表明建立的線性關系良好，可用于滁菊檢測樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分的定量檢測。

測定混合標準品溶液和滁菊樣品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素的保留時間及各峰分離程度，如下圖所示，結(jié)果表明混合標準品溶液中與滁菊檢測樣品溶液中各成分保留時間基本一致，各峰分離程度良好，表明該試驗方法專屬性良好，可用于滁菊中上述8種成分同時檢測。

表3 線性關系

圖1 混合對照品(A)與滁菊樣品(B)HPLC圖

精密稱定已知含量的中國滁州菊花博覽園滁菊藥材粉末6 份，每份約0.125 g，分別精密加入已知量混合標準品溶液，按1.2.3節(jié)下操作制備檢測樣品溶液，進樣10 μL，計算平均加樣回收率(表4)。結(jié)果表明，平均回收率在94.57%～100.01%之間，RSD均小于3%，表明該方法回收率良好。

表4 加標回收試驗(n=6)

續(xù)表4 Table 4 continued

2.2 含量測定結(jié)果

取1.2.3節(jié)下7個不同栽培區(qū)域滁菊檢測樣品溶液，每個樣品平行制備2份，按1.2.1節(jié)色譜條件進樣檢測，進樣10 μL，得不同栽培區(qū)域滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素HPLC色譜圖(圖2)，以不同栽培區(qū)域不同成分峰面積帶入標準曲線方程，即得。含量測定結(jié)果見表5。

表5 不同栽培區(qū)域滁菊含量測定結(jié)果

圖2不同栽培區(qū)域滁菊HPLC色譜圖

Fig.2 HPLC chromatogram of ChuChrysanthemumin different cultivated areas

3 結(jié)論與討論

近年來，多位學者報道了同時測定滁菊及其他藥用菊花多種化學成分的方法。王月茹等建立了HPLC法測定菊花藥材中10 種主要化學成分的含量，作為中藥菊花的質(zhì)量控制的有效方法,為明確不同品種菊花的基原關系和品種鑒定研究提供了數(shù)據(jù)基礎[12]；屠萬倩等建立HPLC法同時測定不同產(chǎn)地菊花中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草素等8 種成分的含量[13]，豐富了菊花的含量測定方法, 更科學、更全面的評價菊花的內(nèi)在質(zhì)量；黃艷梅等在“HPLC結(jié)合化學計量學對不同產(chǎn)地菊花中化學成分的比較分析”中對滁菊進行了多達14 種成分(綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,3-O-二咖啡?？鼘幩?、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷、芹菜素、黃芩苷、蘆丁、咖啡酸、蒙花苷、香葉木素)分析[14]，建立一種分析藥用菊花中14個成分的HPLC方法,并結(jié)合化學計量學方法對不同產(chǎn)地菊花的化學成分進行比較分析。滁菊為著名道地藥材，已成為菊花品種中不可或缺的一部分，目前，HPLC法已常用于菊花的質(zhì)量控制研究，但HPLC法同時測定不同栽培區(qū)域滁菊中多種成分含量尚未見報道，因此，研究不同栽培區(qū)域滁菊中多種成分含量很有必要。本試驗采用HPLC法，建立了同時測定滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分含量的方法。

本試驗最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，以及最佳洗脫梯度(見表1)；流速：0.8 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。通過對該方法進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率考察，表明該方法簡便準確、精密度高、重現(xiàn)性好、平均回收率高。該方法可用于同時測定滁菊中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素8種成分含量，對滁菊質(zhì)量控制具有重要意義。

通過對不同栽培區(qū)域滁菊的含量測定，各生長區(qū)域綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A均明顯高于藥典標準。但不同生長區(qū)域之間成分含量存在明顯差異，其中綠原酸含量最高的為中國滁州菊花博覽園；木犀草苷含量最高的是周崗鄉(xiāng)，其次為中國滁州菊花博覽園；異綠原酸A、異綠原酸C含量最高的均為中國滁州菊花博覽園；黃芩苷含量最高的為周崗鄉(xiāng)，其次為中國滁州菊花博覽園；槲皮素在各生長區(qū)域含量均較少，含量相差不大；木犀草素、芹菜素均以城郊鄉(xiāng)含量最高，且與其他栽培區(qū)域相差較大。試驗結(jié)果說明不同栽培區(qū)域的滁菊化學成分含量差異較大，造成含量差異的原因，以及成分與功效的相關性等相關問題有待進一步深入研究。