組合策略促進(jìn)堿性果膠酶在畢赤酵母中高效表達(dá)

陳雙全 ，劉 松 ，堵國(guó)成 *，陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

堿性果膠酶（EC 4.2.2.2，PGL）可在堿性條件下將果膠質(zhì)裂解為不飽和的寡聚半乳糖醛酸，廣泛應(yīng)用于紡織、食品、造紙及環(huán)境領(lǐng)域[1-2]。為實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)，PGL已在枯草芽孢桿菌[3]、大腸桿菌[4]及畢赤酵母（P.pastoris）[5]中表達(dá)。其中，重組大腸桿菌獲得的PGL產(chǎn)量最高，達(dá)到4 478 U/mL[4]。然而，大腸桿菌表達(dá)PGL仍存在諸多問(wèn)題，包括培養(yǎng)基成本高（蛋白胨類）、需添加價(jià)格昂貴的誘導(dǎo)劑（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）及易感染噬菌體等。對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)，P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有如下優(yōu)勢(shì)：目標(biāo)基因整合于基因組表達(dá)，穩(wěn)定性高；營(yíng)養(yǎng)需求低；易于高密度培養(yǎng)；分泌系統(tǒng)強(qiáng)，胞外雜蛋白極少，目標(biāo)蛋白易于分離純化[6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究中，成功實(shí)現(xiàn)了PGL在P.pastoris中的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)到863 U/mL，經(jīng)補(bǔ)料策略優(yōu)化可進(jìn)一步提高[7]。

大量研究表明，外源蛋白在P.pastoris中高效表達(dá)受一系列因素影響[8-10]。首先，目標(biāo)基因拷貝數(shù)將在基因轉(zhuǎn)錄水平上影響外源蛋白在P.pastoris中的表達(dá)[11]。其次，P.pastoris對(duì)密碼子顯示出偏好性也將在翻譯階段調(diào)控基因表達(dá)[12-13]。此外，外源蛋白的過(guò)量表達(dá)會(huì)引起未折疊蛋白效應(yīng)（UPR），對(duì)外源蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用。UPR包括大量的分泌輔助因子或分子伴侶，如：轉(zhuǎn)錄因子（HAC1）、蛋白二硫鍵折疊酶（PDI）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊氧化還原輔助因子（ERO1）、結(jié)合蛋白（BIP）、泛素共軛酶（UBC1）以及輔助轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌過(guò)程的其他分子伴侶等[14-16]。因此，對(duì)基因拷貝數(shù)、密碼子偏好性及UPR等因素的調(diào)控是促進(jìn)PGL在P.pastoris中表達(dá)的重要策略。

本團(tuán)隊(duì)在前期研究中篩選得到的一株產(chǎn)PGL的Bacillussp.WSHB04-02菌株，經(jīng)分子改造提高了其熱穩(wěn)定性及催化活性[17]。本研究以PGL高熱穩(wěn)定性突變體K314M為研究對(duì)象，通過(guò)密碼子優(yōu)化及過(guò)量表達(dá)分子伴侶ERO1及UBC1，以期提高PGL在P.pastoris中的分泌表達(dá)效率，并在3 L罐水平上考查了重組菌的發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒編碼Bacillussp.WSHB04-02 PGL高熱穩(wěn)定性突變體K314M基因的載體pET-22b（+）/pgl，由本研究室在前期工作中構(gòu)建[17]。 表達(dá)載體pPIC9K及pGAPZA，表達(dá)宿主P.pastorisGS115（his-）及克隆宿主E.coliTOP10均購(gòu)于Invitrogen公司（美國(guó)）。

1.1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoR I、NotI、SacI、BamH I、Bsp119 I、KpnI 和 AvrII 購(gòu) 自ThermoFisher公司 （美國(guó)）。膠回收柱回收試劑盒、Prime STAR HS DNA聚合酶、酵母Total RNA提取試劑盒 （Yeast RNAiso Kit），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser）及定量PCR試劑盒 （SYBR Premix Ex Taq TM Tli RNase H Plus）購(gòu)自大連寶生物Takara公司。One Step Cloning Kit試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、G418、Zeocin、蛋白定量試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。聚半乳糖醛酸購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。其他常用試劑及藥品均為分析純，進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20、酵母提取物10、葡萄糖20。

BMGY 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20、酵母提取物10、甘油 40、YNB13.4、生物素 0.000 4，0.1 M 磷酸鹽緩沖液，pH 6.0。

BMMY 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20、酵母提取物10、YNB13.4、 生物素 0.000 4，9%甲醇 （v/v），0.1 M磷酸鹽緩沖液，pH 6.0。

PTM1 溶 液 （g/L）：CuSO4·5H2O 6.0、KI 0.08、MnSO4·H2O 3.0、Na2MoO4·2H2O 0.2、H3BO30.02、CoCl20.5、ZnCl220.0、FeSO4·7H2O 65.0、生物素 0.2，H2SO45.0 mL/L。

1.2 方法

1.2.1 PGL及分子伴侶表達(dá)載體構(gòu)建

1）PGL表達(dá)載體pPIC9K-PGL構(gòu)建 研究發(fā)現(xiàn)不同物種對(duì)密碼子使用頻率不同，P.pastoris對(duì)密碼子顯示出偏好性，也將在翻譯階段調(diào)控基因表達(dá)[12-13]?；赑.pastoris密碼子偏好性對(duì)PGL高熱穩(wěn)定性突變體K314M的基因優(yōu)化，并克隆至宿主pUC57（金斯瑞生物科技有限公司）。以pUC57-PGL為模板，用引物PGL-F/R（表1）擴(kuò)增PGL基因，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；隨后進(jìn)行34個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min）， 最后 72 ℃保溫10 min。載體pPIC9K用EcoR I及NotI雙酶切，PCR片段及酶切后的載體柱回收，根據(jù)One Step Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TOP10，質(zhì)粒提出得到PGL表達(dá)載體pPIC9K-PGL。未經(jīng)密碼子優(yōu)化的K314M基因通過(guò)引物PGLN-F和PGLN-R從pET-22b （+）/pgl擴(kuò)增得到，并克隆至pPIC9K中EcoR I-NotI位點(diǎn)，得到表達(dá)載體pPIC9K-PGLN。

2）內(nèi)參基因載體pPIC9K-GAPDH構(gòu)建 內(nèi)參基因在各組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定，常用做參照物，在測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平及拷貝數(shù)時(shí)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（GenBank No：U62648.1）常用做內(nèi)參基因[18-19]，以P.pastorisGS115 cDNA為模板，用引物GAPDH-F/R（表1）擴(kuò)增GAPDH基因，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；隨后進(jìn)行34個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）， 最后 72 ℃保溫10 min。載體pPIC9K用EcoR I及NotI雙酶切，PCR片段及酶切后的載體柱回收，根據(jù)One Step Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組連接，得到GAPDH載體pPIC9K-GAPDH。

3）分子伴侶共表達(dá)載體的構(gòu)建 以P.pastorisGS115 cDNA為模板，分別用引物ERO1-F/R和UBC1-F/R （表 1） 擴(kuò) 增 ERO1 （GenBank No：XM_002489600.1） 和 UBC1 （GenBank No：XM_002493814.1）基因。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 5 min，隨后進(jìn)行34個(gè)循環(huán)（95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 1 min）， 最后 72℃保溫 10 min。 載體pGAPZA用Bsp119 I及KpnI雙酶切，PCR片段及酶切后的載體柱回收，根據(jù)One Step Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組連接，分別得到ERO1和UBC1表達(dá)載體pGAPZA-ERO1及pGAPZAUBC1。利用BglII與BamH I為同尾酶效應(yīng)，將構(gòu)建好的pGAPZA-ERO1用BglII與BamH I雙酶切，膠回收得到完整的GAP-ERO1-AOX（TT）表達(dá)框，再與用BamH I單酶切的pGAPZA-UBC1載體連接，得到共表達(dá)ERO1和UBC1的載體pGAPZERO1-UBC1。

表1 本研究中所用PCR引物Table 1 Primers used for PCR in this study

1.2.2 P.pastoris GS115轉(zhuǎn)化與篩選為表達(dá)PGL基因，用SacI將質(zhì)粒pPIC9K-PGL線性化，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)P.pastorisGS115菌株。轉(zhuǎn)化后涂布MD平板，30℃培養(yǎng)3～4 d，經(jīng)MD/MM平板篩選Mut+/Muts菌株，再經(jīng)YPD+1-4 mg/mL G418平板初步篩選基因拷貝數(shù)，挑選5～10個(gè)重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

為共表達(dá)分子伴侶，用AvrII線性化pGAPZAERO1，pGAPZA-UBC1 及 pGAPZA-ERO1-UBC1，電轉(zhuǎn)化至以第1次轉(zhuǎn)化篩選得到的重組菌株GS115/PGL14#，涂布 YPD+100 μg/mL Zeocin 平板，30 ℃培養(yǎng) 3～4 d， 經(jīng) 100～400 μg/mL Zeocin平板初步篩選基因拷貝數(shù)，挑選5～10個(gè)重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.3 重組P.pastoris搖瓶發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)條件：從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中30℃，220 r/min培養(yǎng)14 h，以10%接種量轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h，收集菌體，生理鹽水清洗2次，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中22℃，220 r/min誘導(dǎo)PGL表達(dá)，每24 h補(bǔ)加1.5%甲醇（v/v）。

細(xì)胞生長(zhǎng)情況及酶活每24 h取樣測(cè)定，篩選得到的較優(yōu)重組菌株通過(guò)熒光定量PCR準(zhǔn)確測(cè)定其基因拷貝數(shù)。

1.2.4 3 L罐發(fā)酵從平板上挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h，以10%接種量接種于包含800 mL分批發(fā)酵培養(yǎng)基（85%磷酸 26.7 mL/L，CaSO40.93 g/L，K2SO418.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油 40.0 g/L，PTM14.35 mL/L）的3 L發(fā)酵罐（美國(guó)NBS公司）中，初始攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為2 vvm，50%氨水及30%磷酸控制pH5.5，生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為30℃，當(dāng)甘油耗盡溶氧反彈時(shí)以指數(shù)流加方式補(bǔ)加50%（w/v含 12 mL/L PTM2）甘油，待甘油再次耗盡溶氧反彈時(shí)，饑餓培養(yǎng)2 h，開(kāi)始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基（100%甲醇含12 mL/L PTM2），同時(shí)溫度降低至22℃，攪拌轉(zhuǎn)速升高至900 r/min，誘導(dǎo)PGL表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用分階段流加方式：0～8 h流速2 mL/h，8～90 h流速 9.6 mL/h，＞90 h流速 2 mL/h[20]。 每隔 12 h取樣一次，測(cè)定生物量、酶活、蛋白含量等參數(shù)。

1.2.5 指數(shù)流加指數(shù)流加是建立在對(duì)物料平衡及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)兩方面進(jìn)行合理假設(shè)基礎(chǔ)上的一種較為常見(jiàn)的前置流加控制法，可使限制性基質(zhì)的供給與反應(yīng)器中細(xì)胞量隨時(shí)間的指數(shù)增加相適應(yīng)。流加速率為

式中：F（t）為流加速率，L/h；X0為細(xì)胞密度，gcell/L；V0為初始體積，L；Sf代表補(bǔ)料液中甘油濃度，g/L；YX/S對(duì)底物細(xì)胞得率（gcell/gglycerol）；μset為設(shè)定的比生長(zhǎng)速率（h-1）。 其中 μset為 0.176 h-1，YX/S為 0.435 g/g，Sf為500 g/L[5]。

1.2.6 PGL蛋白純化取發(fā)酵液于4℃，8 000 r/min離心10 min獲得含PGL發(fā)酵上清，將發(fā)酵上清置于冰上，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末，至終濃度40%～60%，離心得富集的粗PGL蛋白，粗蛋白用5 mL緩沖液A （20 mmol/L甘氨酸-NaOH溶液，pH 7.5）復(fù)溶，并置于A液中透析24 h，將樣品用0.22 μmol/L微孔濾膜過(guò)濾，純化使用AKTA純化儀及5 mL 陽(yáng)離子柱（HiTrapTM SP FF 2.5 cm，GE）。柱純化條件如下：用5～10倍柱體積的緩沖液A平衡陽(yáng)離子柱，之后以1 mL/min流速進(jìn)樣，進(jìn)樣結(jié)束以5個(gè)柱體積A液繼續(xù)平衡柱子，流速改為2 mL/min，用洗脫緩沖液B（20 mmol/L甘氨酸-NaOH溶液，pH 7.5，1 mol/L NaCl）梯度洗脫，收集洗脫液，取測(cè)得PGL酶活的洗脫液在A液中透析過(guò)夜，樣品4℃保存。

1.2.7 PGL活力測(cè)定酶活測(cè)定條件為：發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，胞外PGL即包含于發(fā)酵上清液之中，取一定量稀釋做檢測(cè)。PGL反應(yīng)體系[21]：含0.2%聚半乳糖醛酸（底物）的甘氨酸-NaOH緩沖 液 （0.2 mol/L，0.44 mmol/L 的 CaCl2，pH 9.4）2 mL，待測(cè)樣品20 μL，無(wú)活性的酶液為空白對(duì)照。PGL反應(yīng)條件為：將反應(yīng)體系置于45℃下水浴15 min，用 3 mL 磷酸溶液（0.03 mol/L）終止反應(yīng)，在235 nm處測(cè)定吸光度值。單位酶活定義：?jiǎn)挝粫r(shí)間（1 min）裂解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所用的酶量。計(jì)算方法如下

式中：b為比色皿厚度，cm；4 600為不飽和PGA于235 nm處的摩爾吸光系數(shù)，L/mol/cm；t為酶促反應(yīng)時(shí)間（在酶促反應(yīng)線性范圍之內(nèi)），min。

1.2.8 熒光定量PCR目標(biāo)基因拷貝數(shù)通過(guò)RTPCR 測(cè)定[18-19]，定量 PCR 引物（表 1）。 20 μL反應(yīng)體系包括 10 μL SYBR Premix Ex TaqII （Tli RNaseH Plus），0.8 μL RT-PCR F/R 引物 （10 μmol/L），2 μL DNA 模板（＜100 ng），6.4 μL 滅菌蒸餾水。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，30 s預(yù)變性；95 ℃，5 s，55 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。40個(gè)循環(huán)后通過(guò)融解曲線分析特異性。以10倍梯度稀釋的內(nèi)參基因GAPDH及目標(biāo)基因作為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以重組菌株基因組作為RT-PCR的模板，通過(guò)雙曲線法計(jì)算不同重組菌株中相關(guān)基因的拷貝數(shù)。

1.2.9 PGL去糖基化純化后的PGL用去糖基化酶 Endo H（美國(guó) NEB 公司）處理[22]：10 μL PGL 上清，加入 1 μL 10×Glycoprotein Denaturing Buffer混合，100 ℃反應(yīng) 10 min，再加入 2 μL 10×GlycoBuffer 3，2.5 μL Endo H，加水補(bǔ)足至 20 μL，37 ℃反應(yīng) 1 h。

1.2.10 PGL半衰期的測(cè)定重組PGL及突變體的熱穩(wěn)定性用55℃下酶活力半衰期（t1/2，min）來(lái)表示。將純化后的PGL用20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 7.5）稀釋至 100 μg/mL，并在 55 ℃保溫，間隔測(cè)定殘余酶活，將殘余酶活按照文獻(xiàn)所述方式擬合并計(jì)算t1/2[23]。

1.2.11 SDS-PAGE分析樣品與4×加樣Buffer混合，72℃處理10 min，5%濃縮膠及12%分離膠購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），操作參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

圖1 密碼子優(yōu)化后的PGL基因序列Fig.1 Optimized PGL gene sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化對(duì)PGL表達(dá)的影響

P.pastoris對(duì)一些密碼子顯示出偏好性，從而影響編碼基因的表達(dá)效率[13]。研究發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化可使葡萄糖異構(gòu)酶在P.pastoris中的表達(dá)效率提高2.4倍[24]。為提高PGL的轉(zhuǎn)錄及翻譯效率，基于P.pastoris的密碼子偏好性對(duì)Bacillussp.WSHB04-02來(lái)源的PGL基因進(jìn)行優(yōu)化（圖1），使其密碼子適應(yīng)指數(shù) （CAI） 由 0.63提高至 0.84[25]，GC含量從46.64%降為42.41%?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，不適宜的GC峰也被優(yōu)化以延長(zhǎng)mRNA的半衰期；影響mRNA穩(wěn)定性及核糖體結(jié)合的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞掉；消極的順式位點(diǎn)也被成功修飾。

將Bacillussp PGL基因克隆至pPIC9K中的EcoR I-NotI位點(diǎn)，構(gòu)建得到PGL表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-PGL （圖 2 （a）），轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115（his-）得到重組菌GS115/PGL轉(zhuǎn)化子，經(jīng)MD/MM平板篩選Mut+/Muts菌株，獲得表型為Mut+的數(shù)十株菌株，再經(jīng)不同濃度梯度G418平板篩選，從1～4 mg/mL平板上各挑取10個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵96 h。其中，菌株GS115/PGL 9#、14#和19#胞外酶活分別為256.35、301.32 U/mL和273.24 U/mL。重組菌株P(guān)GL基因拷貝數(shù)使用RT-PCR進(jìn)行確定（表2），PGL拷貝數(shù)為3時(shí)重組菌株具有最佳的PGL表達(dá)能力。未經(jīng)密碼子優(yōu)化的PGL基因克隆至pPIC9K中的EcoR I-NotI位點(diǎn)得到pPIC9K-PGLN，轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115（his-）得到含3個(gè)拷貝數(shù)PGL基因的重組菌GS115/PGLN。在相同拷貝情況下，GS115/PGL 14#較GS115/PGLN胞外PGL酶活提高25.1%，表明密碼子優(yōu)化能有效提高PGL在P.pastoris分泌表達(dá)。

圖2 重組質(zhì)粒示意圖Fig.2 Schematic plot of recombinant plasmids

表2 重組菌生產(chǎn)性能及PGL基因拷貝數(shù)Table 2 Productivity of recombinant strains and copy numbers of PGL gene

2.2 共表達(dá)分子伴侶對(duì)PGL胞外表達(dá)的影響

共表達(dá)UPR相關(guān)分子伴侶可有效減緩未折疊蛋白效應(yīng)，促進(jìn)外源蛋白在P.pastoris中的表達(dá)[14-16]。ERO1可以輔助促進(jìn)外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊，UBC1可以通過(guò)泛素化作用輔助錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，共表達(dá)ERO1及UBC1可有效促進(jìn)外源蛋白正確折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的快速降解，從而緩解細(xì)胞代謝壓力，促進(jìn)外源蛋白高效表達(dá)。為提高PGL胞外表達(dá)水平，在重組菌GS115/PGL 14#中分別共表達(dá)ERO1及UBC1。將ERO1及UBC1基因克隆至pGAPZA中的Bsp119 I-KpnI位點(diǎn)，構(gòu)建得到表達(dá)質(zhì)粒 pGAPZA-ERO1（圖 2（b））和 pGAPZA-UBC1（圖 2（c）），電轉(zhuǎn)化 GS115/PGL 14#，得到 10 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。經(jīng)過(guò)96 h甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，PGL酶活達(dá)到最大值，其中重組菌GS115/PGL-ERO1 6#及GS115/PGL-UBC1 3#的PGL酶活分別達(dá)到408.27 U/mL 及 368.54 U/mL（圖 3），較出發(fā)菌分別提高35.5%及22.3%。

為提進(jìn)一步提高PGL產(chǎn)量，在重組菌GS115/PGL 14#中共表達(dá) ERO1及 UBC1。將pGAPZAERO1用BglII與BamH I雙酶切，得到GAPERO1-AOX（TT）表達(dá)框，克隆至BamH I單酶切的pGAPZA-UBC1載體，得到共表達(dá)載體pGAPZERO1-UBC1（圖2d）。發(fā)酵結(jié)果顯示，GS115/PGLERO1-UBC1 2#重組菌株其最大酶活達(dá)到450.12 U/mL，相比于出發(fā)菌株提高49.3%（圖3）。

圖3 重組菌搖瓶發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.3 Fermentation process curve of the recombinant strains in shake flask

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，應(yīng)用RT-PCR測(cè)定了重組菌中分子伴侶的基因拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#中ERO1與UBC1基因拷貝數(shù)分與GS115/PGL-REO1 6#和GS115/PGL-UBC1 3# 相同（表 3）。

2.3 3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

分批補(bǔ)料發(fā)酵是一種簡(jiǎn)單有效的發(fā)酵模式，可在短時(shí)間內(nèi)增加P.pastoris菌體濃度來(lái)提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量以及生產(chǎn)強(qiáng)度。通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵及相關(guān)參數(shù)優(yōu)化，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量可以提高數(shù)倍之多[26-27]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究PGL時(shí)，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵策略提高了PGL的表達(dá)水平[5，7]。因此，比較了重組菌GS115/PGL 14#及GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#在3 L罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵。

表3 RT-PCR測(cè)定共表達(dá)基因拷貝數(shù)Table 3 Copy numbers of co-expressing gene detected by real-time PCR

發(fā)酵起始采取分批培養(yǎng)，在第19 h DO反彈初始甘油耗盡后，開(kāi)始采用指數(shù)流加方式流加50%的甘油溶液，控制比生長(zhǎng)速率（μset）為 0.176 h-1，指數(shù)流加19 h，當(dāng)甘油耗盡DO再次反彈后，饑餓培養(yǎng)2 h后開(kāi)始分階段 （0～8 h流速2 mL/h，8～90 h流速9.6 mL/h，＞90 h流速2 mL/h）流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)重組菌生產(chǎn)PGL[20]。如圖4所示，在20～40 h細(xì)胞生長(zhǎng)較快，誘導(dǎo)發(fā)酵初期菌體依然緩慢生長(zhǎng)，至發(fā)酵后期 （100～160 h）菌體量不再增加，此時(shí)重組菌GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#的細(xì)胞干重可達(dá)120 g/L，組合共表達(dá)ERO1及UBC1的重組菌株GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#在誘導(dǎo)96 h時(shí)PGL酶活達(dá)到最大值為1 362.31 U/mL，相比于未共表達(dá)分子伴侶的重組菌株GS115/PGL 14#的934.34 U/mL提高45.8%，且菌體生長(zhǎng)更好。這些結(jié)果表明共表達(dá)分子伴侶ERO1及UBC1可有效促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及外源蛋白表達(dá)。

圖4 重組菌3 L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.4 Fermentation process curve of the recombinant strains during fed-batch fermentation in the 3 L fermentor

為進(jìn)一步研究糖基化對(duì)PGL表達(dá)的影響，通過(guò)陽(yáng)離子柱純化方法從GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#誘導(dǎo)96 h發(fā)酵上清中分離純化得到PGL純酶。圖5中SDS-PAGE分析顯示，純化后的PGL蛋白條大小為47 kDa和49kDa，較PGL理論分子量43.5 kDa偏大。純化的PGL經(jīng)去糖基化酶Endo H處理后，PGL主要轉(zhuǎn)化為43.5 kDa蛋白及其它未知低分子量蛋白，上述結(jié)果表明，PGL在P.pastoris表達(dá)后發(fā)生了糖基化。研究表明，糖基化對(duì)酶分子在酵母表達(dá)水平有重要作用[22，28]。在下一步工作中，將通過(guò)去糖基化修飾來(lái)進(jìn)一步提高PGL的胞外表達(dá)水平。此外，GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#生產(chǎn)的PGL 55℃下酶活力半衰期較野生酶提高81.3%，達(dá)到1.16 h，穩(wěn)定性明顯提升。

圖5SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis

3 結(jié)語(yǔ)

本研究表明系統(tǒng)性的密碼子偏好性優(yōu)化及共表達(dá)分子伴侶可顯著促進(jìn)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)及外源蛋白PGL的表達(dá)。單獨(dú)共表達(dá)分子伴侶ERO1或UBC1對(duì)促進(jìn)PGL的表達(dá)擁有較好效果，組合共表達(dá)ERO1-UBC1效果更加顯著，也說(shuō)明兩個(gè)分子伴侶之間擁有積極的相互作用。在相同分批發(fā)酵條件下，改造后的重組菌GS115/PGL-ERO1-UBC1 2#胞外PGL酶活達(dá)到1 362.31 U/mL，較改造前PGL酶活 863 U/mL提高 57.9%[7]。此外，GS115/PGLERO1-UBC1 2#生產(chǎn)的PGL55℃下酶活力半衰期較野生酶提高81.3%，達(dá)到1.16 h，穩(wěn)定性明顯提升。研究結(jié)果對(duì)促進(jìn)PGL產(chǎn)量的提升及其應(yīng)用具有重要現(xiàn)實(shí)意義。