龍須菜蛋白酶解制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化

余 虹，操德群，何艷麗，徐年軍

（寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211）

龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）是一種有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋紅藻。龍須菜屬于溫暖性海藻，最適生長溫度為12～22℃，主要分布在我國山東半島和遼寧沿海[1]。經(jīng)過選育獲得的龍須菜981品系目前已經(jīng)在福建、廣東、山東大面積養(yǎng)殖。龍須菜生長周期短，每年的春秋兩季為龍須菜的快速生長期。龍須菜藻體的瓊膠含膠量高達(dá)20%～30%，是目前江蘺屬中最好的瓊膠來源[2-3]，經(jīng)過堿改性的瓊膠可以與石花菜媲美：凝膠強(qiáng)度高，半乳糖含量高，同時(shí)硫酸根含量低。龍須菜是一種可以大規(guī)模培養(yǎng)的物種，在我國已經(jīng)成為繼海帶、紫菜之后的第三大栽培海藻[4]。目前，龍須菜活性物質(zhì)的研究主要集中在藻紅蛋白和多糖提取物上，對于其活性肽的應(yīng)用研究極少。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （Angiotensin Converting Enzyme，ACE）是一種糖蛋白，是膜結(jié)合的二羧基酶，含有Zn2+和Cl-，主要存在于人體組織及血漿中[5-8]。ACE是多功能酶，在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-Kinin System，KKS）和體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin System，RAS）中對血壓調(diào)節(jié)有著重要的作用[9-13]。如果抑制了ACE的活性，就能有效的預(yù)防高血壓，現(xiàn)在廣泛研究的降血壓肽就是ACE抑制劑[14-15]。

本試驗(yàn)采用胰蛋白酶酶解龍須菜粗蛋白制備多肽，并以多肽對ACE的抑制率指標(biāo)對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，為龍須菜的高效利用開發(fā)新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜：產(chǎn)自于浙江溫州；堿性蛋白酶Alcalase：諾維信公司；風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme：諾維信公司；木瓜蛋白酶Pepsin、胰蛋白酶、ACE：Sigma公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：FD-1C-80冷凍干燥機(jī) （北京博醫(yī)康）；Sorvall ST 16R冷凍離心機(jī) （賽默飛世爾）；SpectraMax 190全波段酶標(biāo)儀 （Molecular Devices，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗蛋白提取新鮮龍須菜 （浙江溫州）→自來水沖洗（快速）→純水清洗（快速）→瀝干水分→-20℃凍藏→冷凍干燥→剪碎→粉碎→過篩→龍須菜粉末。

龍須菜粉末→0.01 mol/L PB緩沖液（pH 7.0，固液比為1∶20）→-20℃冷凍6 h→常溫水浴解凍后4℃低溫浸提12 h（上述步驟重復(fù)4次）→浸提液減壓抽濾后低溫離心 （4℃，8 000 r/min，15 min）→上清液-20℃凍藏→冷凍干燥→龍須菜粗蛋白。

1.2.2 酶解液對ACE抑制活性的測定根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]計(jì)算ACE抑制率。

空白對照組：于96孔石英酶標(biāo)板中將100 μL FAPGG溶液和40 μL Tris-HCl緩沖液混合；

實(shí)驗(yàn)組：于 96孔石英酶標(biāo)板中將 100 μL FAPGG溶液和40 μL ACE抑制肽溶液混合；

然后將其置于37℃下孵育5 min，在分別加入60 μL ACE 溶液，啟動(dòng)反應(yīng)（37 ℃下），酶標(biāo)板振蕩10 s后，用酶標(biāo)儀于340 nm處檢測30 min，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，分別計(jì)算出空白對照組和實(shí)驗(yàn)組的斜率（取20～30 min數(shù)據(jù)），求出ACE抑制率，其中ACE抑制率公式為

1.2.3 酶的篩選將龍須菜蛋白用0.01 mol/L PB緩沖液（配成各自酶的適宜pH）進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)見表1。其中底物質(zhì)量濃度為20 mg/mL，酶底比為4%。

表1 蛋白酶酶解條件Table 1 Condition of enzymatic hydrolysis

酶解反應(yīng)結(jié)束后，于100℃水浴15 min，之后迅速冰浴30 min，再于4℃，8 000 r/min下冷凍離心15 min，上清液-20℃凍藏，冷凍干燥，凍干粉-20℃下保存，備用。

分別檢測4種蛋白酶酶解液凍干粉（酶解得到的ACE抑制肽）的ACE抑制活性和水解度（每個(gè)樣品做3次平行檢測），篩選出適合的酶，然后用該酶做單因素以及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)以ACE抑制率為指標(biāo)，考察pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、酶與底物比5個(gè)因素對酶解效果的影響。

考察pH的影響：固定底物濃度為20 mg/mL，酶底比為4%，酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為8 h，設(shè)定酶解 pH 分別為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，考察酶解pH對ACE抑制活性的影響。

考察溫度的影響：固定酶解pH為8.5，底物質(zhì)量濃度為15 mg/mL，酶底比為4%，酶解時(shí)間為8 h，設(shè)定酶解溫度分別為 30、33、37、40、45、50 ℃，考察酶解溫度對ACE抑制活性的影響。

考察時(shí)間的影響：固定酶解pH為8.5，底物濃度為15 mg/mL，酶底比為4%，酶解溫度為37℃，設(shè)定酶解時(shí)間分別為 1、2、4、6、8、10、12 h， 考察酶解時(shí)間對ACE抑制活性的影響。

考察底物質(zhì)量濃度的影響：固定酶解pH為8.5，酶底比為4%，酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為8 h，設(shè)定底物質(zhì)量濃度分別為 5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg/mL，考察底物質(zhì)量濃度對ACE抑制活性的影響。

考察酶與底物比的影響：固定酶解pH為8.5，底物質(zhì)量濃度為15 mg/mL，酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為 8 h， 設(shè)定酶底比分別為 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0%，考察酶底比對ACE抑制活性的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對顯著性影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝。采用Design-Expert 8.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化酶解工藝。在計(jì)算得到最佳工藝后，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，在各自適宜的條件下，胰蛋白酶的酶解效率較高，相比之下，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解作用顯著低于胰蛋白酶（P＜0.05）。僅從ACE抑制率來看，胰蛋白酶適合酶解龍須菜粗蛋白。

圖1 4種酶解液ACE抑制活性Fig.1 ACE inhibitory activity of 4 kinds of enzymatic hydrolysates

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH值對ACE抑制活性的影響從圖2看出，pH對龍須菜酶解液的ACE抑制率影響很大，在PH為8以內(nèi)，ACE抑制率隨著pH值升高而明顯增加（P＜0.05）；而在pH為8之后，ACE抑制率變化不再明顯（P＞0.05）。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是胰蛋白酶是蛋白質(zhì)，過酸或過堿的環(huán)境會(huì)影響蛋白的活性[18]。所以制備ACE抑制肽優(yōu)化試驗(yàn)選擇最適宜pH 8。

圖2 pH值對ACE酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on ACE inhibitory activity

2.2.2 酶解溫度對ACE抑制活性的影響由圖3可知，酶解溫度對龍須菜酶解液的ACE抑制率也有很大的影響，酶解液對ACE的抑制率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到37℃之后，隨著溫度的升高，ACE 抑制率顯著下降（P＜0.05），這可能是由于溫度過高從而使胰蛋白酶失活，酶解效果不理想[19]。因此優(yōu)化試驗(yàn)最佳值選擇37℃。

圖3 酶解溫度對ACE酶活性的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

2.2.3 酶解時(shí)間對ACE抑制活性的影響圖4顯示的是酶解時(shí)間對龍須菜酶解液ACE抑制率的影響，酶解時(shí)間對ACE抑制率的影響不大，在酶解時(shí)間 1～4 h 內(nèi)，ACE 抑制率變化不明顯（P＞0.05）。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)，抑制率顯著提高（P＜0.05），可是隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，抑制率又顯著低于6 h時(shí)對ACE 的抑制率（P＞0.05），可能是底物濃度不夠，反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。

圖4 酶解時(shí)間對ACE酶活性的影響Fig.4 Effect of time on ACE inhibitory activity

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制活性的影響由圖5可知，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5～15 mg/mL時(shí)，ACE抑制率呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05），當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)在15～30 mg/mL時(shí)，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，ACE抑制率變化不明顯（P＞0.05）。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最高值。

圖5 底物質(zhì)量濃度對ACE酶活性的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

2.2.5 酶底比對ACE抑制活性的影響由圖6可以看出酶添加量與底物比對龍須菜酶解液的ACE抑制率的影響，隨著酶添加量的增加，ACE抑制率整體呈上升趨勢，但是當(dāng)酶與底物比達(dá)到4.0%之后，隨著酶與底物比的升高，ACE抑制率增加不明顯。所以優(yōu)化試驗(yàn)選擇4.0%。

圖6 酶添加量對ACE酶活性的影響Fig.6 Effect of the adding quantity on ACE inhibitory activity

2.3 酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果，綜合Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，固定底物質(zhì)量濃度為15 mg/mL，酶解時(shí)間為6 h，選取酶解 pH（A），酶底比（B），酶解溫度（C）這3個(gè)對ACE抑制活性影響較大的因素作為考察變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平見表2。

表2 酶解工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Variables and their coded values used in the Box-Behnken design for optimizing the hydrolysis conditions

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。具體響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。采用design-expert 8.0對結(jié)果進(jìn)行分析，模型方差分析如表4所示。模型及失擬項(xiàng)的P值分別為0.005和0.112 3，表明該模型為回歸顯著型。溫度對ACE抑制率都有顯著的影響。ACE抑制率與各因素的回歸方程為：ACE抑制率/%=70.57+0.30A+0.41B-1.77C-1.43A×B-1.88A×C-3.46B×C-2.48A2-0.60B2-3.30C2。

采用Design-Expert 8.0軟件處理該響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，見圖7～圖9。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及ACE抑制率的測定結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and response values of ACE inhibitory activity

表4 ACE抑制率的方差分析Table 4 Variance analysis for ACE inhibitory activities

圖7 pH和酶底比的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plot of pectinase concentration and pH

圖8 pH和溫度的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface plot of temperature and pH

圖9 酶底比和溫度的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface plot of temperature and pectinase concentration

由圖 7可知，當(dāng)溫度在34～40℃時(shí)，pH與酶底比的交互作用影響酶解液對ACE的抑制率。當(dāng)酶底比一定時(shí)，ACE抑制率隨著pH的增大先增加后略微減小，pH在8.0時(shí)，酶解液對ACE的抑制率較高。 當(dāng)pH一定時(shí)，ACE抑制率隨著酶底比的升高而略微增加，但是增加不明顯。

由圖 8可知，當(dāng)酶底比在2～6時(shí)，溫度與pH的交互作用顯著影響酶解液對ACE的抑制率的。 當(dāng)pH一定時(shí)，ACE抑制率隨著溫度的增大先增加后減小，溫度在37℃時(shí)，酶解液對ACE的抑制率較高。 當(dāng)溫度一定時(shí)，ACE抑制率隨著pH的增加而增加，當(dāng)pH達(dá)到8時(shí)，ACE抑制率增長趨勢放緩。

由圖9可知，當(dāng)pH在7.5～8.5時(shí)，溫度與酶底比的交互作用顯著影響酶解液對ACE的抑制率的。當(dāng)溫度一定時(shí)，ACE抑制率隨著酶底比的升高而增大。 當(dāng)酶底比一定時(shí)，ACE抑制率隨著溫度的增加而先增加后下降，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，ACE抑制率最大。

根據(jù)回歸模型，得到最佳酶解工藝為：pH為8.04，酶底比為6%，溫度為34.6℃，考慮實(shí)際生產(chǎn)情況，工藝調(diào)整為pH為8.0，酶底比為6%，溫度為35℃，在此條件下，酶解液對ACE的抑制率預(yù)測值為72.46%。為了驗(yàn)證回歸模型的可靠性，對最佳酶解工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，抑制率為72.37%，接近模型預(yù)測值，說明該響應(yīng)面優(yōu)化工藝獲得的最佳酶解工藝是可靠的。

3 結(jié)語

1）酶是具有活性的蛋白，它具有高效性和專一性，因此蛋白酶的選擇就是酶解過程的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)選用4中常見蛋白酶酶解龍須菜蛋白，采用對ACE抑制率為指標(biāo)，對蛋白酶進(jìn)行篩選，最后發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶酶解龍須菜蛋白效率最高。

2）采用酶解技術(shù)制備的多肽能很好的抑制ACE酶活性。胰蛋白酶是適合酶解龍須菜蛋白制備ACE抑制肽的蛋白酶。在最優(yōu)條件下制備的多肽對ACE酶有很高的抑制作用。

3）經(jīng)過優(yōu)化的最佳制備工藝為：pH為8.0，酶底比為6%，溫度為35℃，在此條件下，制備的多肽對ACE的抑制率為72.37%。