萊茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表達、純化和多克隆抗體的制備及鑒定

董 彬 ，吳 松 ，程榮強 ，孟德梅 ，2，樊振川 *，2

（1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457；2.天津科技大學 新農村發(fā)展研究院，天津 300457）

巴-比二氏綜合征 （Bardet-Biedl Syndrome，BBS）是一種由細胞纖毛功能障礙所引起的一類遺傳病[1]，其主要癥狀包括肥胖癥[2]，視網膜病變[3]及腎囊腫[4]等病癥，因此是一類“纖毛病”。目前，在人體中鑒定出的與BBS有關的基因有12個（bbs1-12）[5]，其中由bbs1/2/4/5/7/8/9編碼的蛋白與BBIP10蛋白形成一個蛋白復合體稱為BBSome[6]。研究表明BBSome在纖毛信號傳導中起著重要作用，但與纖毛組裝和維持并無關聯。因此，闡明BBSome組裝、纖毛運輸和信號傳導機理是攻克BBS的前提。由于纖毛在物種間高度保守，因此具纖毛單細胞微藻-萊茵衣藻很早以來就已被用作一種模式生物用于研究纖毛組裝、維持和信號傳導。多項研究表明，萊茵衣藻BBSome定位于細胞基體和纖毛內，是由7個 BBSome 蛋白亞體包括 BBS1，2，4，5，6，8 和 9 組成的蛋白復合物，其進入纖毛嚴格依賴于纖毛內運送體系統(tǒng)（Intra Flagellar Transport，IFT）的完整[7-8]，在這一運輸過程中，BBSome作為一個纖毛貨物蛋白和IFT相偶聯[9]。除此之外，由于缺少萊茵衣藻BBSome突變體及其相對應的抗體，使得對這些基因及其蛋白產物在BBSome組裝和纖毛運輸中的功能研究難以繼續(xù)。

BBS2是BBSome眾多蛋白亞體中非常保守的一個組分，其突變可導致視網膜病變，攝食增多型的肥胖及腎囊腫的形成[10]。目前，萊茵衣藻BBS1、BBS4和BBS7突變體已經被鑒定，缺少這些蛋白亞體均可導致BBSome解聚，使得纖毛信號傳導蛋白在纖毛內過度聚集[6]。因此人們推測這就是導致BBS的原因。利用萊茵衣藻來研究bbs2在纖毛信號傳導中的功能，將會對完全闡明人類bbs2的功能提供基礎，對BBS病因的探索具有重要的理論意義。

由于國際上目前還沒有針對萊茵衣藻BBS2蛋白的抗體可用，因此制備高特異性和靈敏性的萊茵衣藻BBS2抗體就成為了闡明BBS2在BBSome組裝和纖毛信號傳導中的功能的關鍵因素之一。本文作者采用了簡單經濟的原核表達方法第一次制備了高純度的萊茵衣藻BBS2部分蛋白抗原，利用高濃度尿素溶解法對其進行了可融化處理，進而利用新西蘭大白兔為免疫動物制備出了抗萊茵衣藻BBS2的多克隆抗體。利用Western blotting和免疫熒光染色等方法進行的檢測鑒定表明該多克隆抗體能特異性識別萊茵衣藻BBS2蛋白，從而為全面鑒定BBS2在BBSome組裝和纖毛信號傳導中的功能和最終理解BBS致病分子機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒大腸桿菌 （Escherichia coli）XL1-blue和BL21（DE3）菌株以及重組質粒pMAL-c2x-bbs2和pET28a為本實驗室保存。萊茵衣藻藻種CC-125購自美國萊茵衣藻中心（www.chlamy.org）。

1.1.2 主要試劑限制性內切酶HindIII和BamH I、pfuDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和蛋白Marker等均購自美國Thermo公司；1 Kb DNA Marker購自北京全式金公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、卡那霉素、IPTG購自北京索萊寶生物科技有限公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白純化介質和Protein A SepharoseTMCL-4B抗體純化介質均購自美國GE Healthcare公司；NC膜購自美國PALL公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑均購自美國Sigma公司；過氧根辣酶 （HRP）標記的羊抗兔抗體購自美國Jackson immunoresearch公司；ECL顯色試劑購自美國Millipore公司，其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 實驗動物新西蘭雄性大白兔2只，體重1.5～2.0 kg，由天津歐陽實驗種兔場提供。

1.2 方法

1.2.1 pET28A-bbs2原核表達載體構建以pMAL-c2x-bbs2為模板和5'-AGGGATCCATGCT CGTGCCGGCCTTC-3'（5'-引入BamH I酶切位點）和5'-AGAAGCTTCTGTATTGAGCAGTTCCCG-3'（5'-端引入HindIII酶切位點）為引物擴增BBS2基因5'端399 bp的cDNA序列。所得DNA片段用DNA產物回收試劑盒回收后進行BamH I和HindIII雙酶切。酶切產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后與BamH I和HindIII雙酶切的載體pET28a進行連接。將連接產物轉入E.coliXL1-blue感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布于LB平板 （含100 μg/mL卡那霉素）過夜培養(yǎng)以進行抗性菌落篩選，挑取抗性菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質粒并對其進行酶切和核酸測序進行驗證，驗證正確的重組質粒命名為pET28a-bbs2。PCR擴增反應條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃40 s，30個循環(huán)。爾后取2 μL PCR產物在0.8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

1.2.2 6×His-BBS2融合蛋白的誘導表達及鑒定將pET28a-bbs2轉化至大腸桿菌BL21（DE3）進行鋪板培養(yǎng)，挑取新鮮單菌落于LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL 卡那霉素）過夜培養(yǎng)，再以 1∶20 的比例放大進行培養(yǎng)，直至其OD值位于0.6～0.8區(qū)間，爾后加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG在28℃溫度條件下誘導6 h使重組蛋白6×His-BBS2大量表達，同時設置不加IPTG誘導的對照組。最后，離心收集菌體并用超聲波對其進行裂解以獲得全蛋白。對全蛋白經離心（12 000 r/min，15 min，4 ℃）收集上清和沉淀。最后分別取全蛋白、上清和沉淀與2×蛋白上樣緩沖液進行混合，爾后在12%的SDS-PAGE中對其進行電泳檢測。

1.2.3 6×His-BBS2融合蛋白的純化將離心回收后的沉淀用2 mol/L尿素溶液漂洗3次，然后高速離心回收沉淀（12 000 r/min，15 min，4 ℃）并使之溶解于8 mol/L尿素溶液中。用0.45 μm濾膜過濾溶液后加入用含有8 mol/L尿素平衡液 （50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 預平衡好的 Ni Sepharose High Performance純化柱，并于室溫使其結合1 h。爾后使樣品流經純化柱，并用含有8 mol/L 尿素平衡液 （50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4）作為洗滌緩沖液漂洗五次以去除雜蛋白，最后用含有8 mol/L尿素的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L imidazole，pH 7.4）洗脫并收集目的蛋白并將洗脫出的目的蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳分析[12-13]。對于純化得到的6×His-BBS2不進行溶液置換或透析，直接將其以含有8 mol/L尿素的變性蛋白形式進行免疫，利用微量蛋白測定儀測定蛋白濃度，并稀釋其到終濃度為1 mg/mL準備免疫。

1.2.4 多克隆抗體的制備每個抗原免疫兩只兔子，實驗所用兔子為3月齡、體重在1.5～2 kg的雄性新西蘭大白兔，在本實驗室動物房適應1周后進行第1次免疫，采用皮下多點注射的方式免疫，每只兔子每次免疫1 mg抗原，初次免疫前耳部取血[14]作為后期實驗陰性對照，取2 mL純化后的6×His-BBS2融合蛋白（1mg/mL）與2 mL弗氏佐劑等體積混合后乳化完全，免疫新西蘭大白兔，采用頸背部多點注射法。其后每10 d依照此劑量進行一次加強免疫，但乳化劑改為弗氏不完全佐劑，一共加強免疫4次，第5次免疫后抽取耳動脈血，測定抗血清的效價。效價合格后，采用心臟穿刺法收集全血，4℃靜置過夜后在4 000 r/min的條件下離心30 min，去除沉淀血漿從而收集抗血清，按每毫升分裝凍存于-80℃。

1.2.5 多克隆抗體效價的檢測采用間接ELISA法測定抗血清的效價，以純化后的6×His-BBS2融合蛋白作為包被抗原，用5%的脫脂牛奶37℃封閉1 h，隨后，加入經PBS溶液（pH 7.5）梯度稀釋的兔血清37℃孵育1 h；加入經PBS溶液（pH 7.5）稀釋20 000倍的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育 30 min；然后加入 TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯苯胺）顯色液，室溫避光顯色30 min，最后加入0.5 mol/L H2SO4終止液，終止反應。利用酶標儀測定OD450處的吸光值，并計算出抗血清的效價，實驗組血清OD450陰性對照血清OD450≥2.0為陽性，其最高稀釋度即為抗血清的效價[15-16]。

1.2.6 多克隆抗體的純化使用Protein A SepharoseTMCL-4B親和純化專一性吸附抗血清中的IgG，去除IgG之外的其他抗體分子，純化條件為：結合緩沖液 （12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液（0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.7），流速0.5 mL/min。收集吸收峰對應的洗脫液，用 1 mol/L Tris-HCl（pH=9.0）將洗脫液 pH 值調至中性，經Western blotting檢測多克隆抗體的特異性[17]。

1.2.7 免疫印跡法檢測多克隆抗體的特異性取1 mL培養(yǎng)至對數期（2×106cell/mL）的CC-125細胞藻液，在2 500 r/min條件下于室溫離心2 min，移除上清，加入 60 μL Buffer A（0.1 mol/L Na2CO3，0.1 mol/L DTT）， 隨后加入 40 μL Buffer B （5%SDS，30%Sucrose）。樣品隨后于4℃在恒溫震蕩儀中震蕩45 min（2 000 r/min），以使細胞充分裂解。細胞裂解液隨后于4℃和12 000 r/min離心條件下離心5 min，爾后移取上清至新的EP管待定量和上樣。蛋白定量按照Amido black的傳統(tǒng)方法[19]進行。取20 μg細胞全蛋白，加入 5×Loading Buffer，沸水浴 5 min，12 000 r/min離心5 min，上樣，進行SDS-PAGE電泳（150 V，1.5 h），結束后進行濕法轉膜（50 V，45 min），然后，用5%的脫脂奶粉封閉；多克隆抗體稀釋度1∶5 000，二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔 IgG（Jackson，Cat.No.111-035-003），稀釋度為1∶100 00，之后在暗室向膜上加入ECL顯色液[18]（Millipore，Cat.No.WBKLS0500），反應 3 min 后，使用暗盒壓片（壓片時間為1 min），顯影，定影，晾干拍照。

1.2.8 免疫熒光法檢測多克隆抗體的特異性取30～50 μL 培養(yǎng)至對數期 （2×106cell/mL） 的衣藻CC-125細胞藻液，對細胞進行計數，2 500 r/min離心丟棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸。 取50 μL的細胞，加入等體積的4%PFA，室溫固定5 min。2 500 r/min離心 1 min，離心丟棄上清，加入 100 μL PBS緩沖液重懸。取50 μL細胞滴在干凈的載玻片中，室溫放置5 min。吸干上層液體，將玻片放入-20℃的甲醇中固定1 min。取出玻片晾干，加入PBS緩沖液處理5 min，使細胞水化。吸走緩沖液，向玻片滴加 25 μL 5%BSA進行封閉，4℃封閉1 h。加入稀釋的一抗 （1∶50），25 μL，4 ℃，2 h， 用 PBS （含有0.2%Tween-20）洗3次，每次5 min，加入稀釋的熒光標記的羊抗兔二抗（1∶400，Invitrogen，Alexa Fluor 594 dye），4 ℃反應 2 h。 用 PBS（含有 0.2%Tween-20）洗3次，每次5 min，最后用超純水洗一次去除鹽分。在載玻片上滴加抗熒光淬滅封片劑（索來寶，抗熒光衰減封片劑），蓋上洗干凈的蓋玻片，用指甲油把蓋玻片四周固定，黑暗中干燥 2 h以上，使其凝固，用熒光顯微鏡拍照[20]。

2 結果與分析

2.1 pET28a-bbs2原核表達載體的構建

以pMAL-c2x-bbs2為模板，利用PCR擴增獲得bbs2基因5′端大小為399 bp的cDNA片段 （編碼 133個氨基酸）（見圖 1（a））。將空表達載體pET28a用BamH I和HindIII雙酶切，回收片段并進行電泳驗證（見圖1（b））。進行連接反應獲得重組表達質粒pET28a-bbs2后對其進行雙酶切鑒定（見圖1（c）），可獲得條帶大小為399 bp的目的片段和5 kb的載體片段，該質粒經測序驗證其插入序列完全正確，說明表達載體構建成功。

圖1 bbs2的PCR擴增和重組表達質粒的驗證Fig.1 PCR amplication of bbs2 and identification of recombinantexpression plasmid by restriction digestion

2.2 6×His-BBS2融合蛋白的誘導表達鑒定

在IPTG的誘導下，含有pET28a-bbs2質粒的大腸桿菌BL21（DE3）菌株會大量表達目的蛋白，菌體經超聲破碎后獲得全蛋白，所得全蛋白經低溫高速離心分離上清和沉淀，然后經電泳、染色、脫色后分別在約15 kDa處可以看到目的蛋白大量表達，且蛋白的表達主要以包涵體的形式存在。其表達結果如圖2所示。

圖 2 SDS-PAGE檢測重組蛋白 6×His-BBS在 E.coli BL21（DE3）中的表達Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein 6×His-BBS in E.coli BL21（DE3）

2.3 6×His-BBS2融合蛋白的純化

由上述可知6×His-BBS2融合蛋白的表達主要在沉淀中，因此將誘導表達后的菌體經超聲破碎以及高速離心后取沉淀，溶解于8 mol/L尿素于Ni Sepharose High Performance純化柱中進行親和純化，由于融合蛋白所含有的6×His標簽能夠特異性與上述填料結合，因此經過洗滌、洗脫等步驟，即得到比較單一的的目的蛋白（如圖3所示），可作為免疫動物所用抗原。

圖3 SDS-PAGE檢測親和純化后6×His-BBS2重組蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified 6×His-BBS2 recombinant protein by affinity adsorption purification

2.4 抗血清效價的檢測

用純化得到的6×His-BBS2融合蛋白免疫新西蘭大白兔，經耳緣靜脈少量采血，室溫靜置2 h或4℃過夜后獲得析出血清，以間接ELISA法測定抗血清的效價，利用酶標儀測定OD450處的吸光值后計算出抗血清的效價，結果見圖4。

圖4 間接ELISA法測定抗血清的效價Fig.4 Results of ELISA test of anti-BBS2 polyclonal antiserum

以實驗組血清OD450與陰性對照血清OD450的比值大于2即為陽性，其最高稀釋度即為抗血清的效價，如圖4可知1號兔抗血清的效價大于128 000，2號兔抗血清效價大于256 000，滿足實驗要求。

2.5 抗血清純度和特異性檢測

所得的抗血清由于含有多種抗體分子因此需要進行純化，本研究進行Protein A純化，以得到抗血清中的IgG。對純化得到的IgG進行電泳，在丙烯酰胺凝膠上25 kDa及55 kDa左右可見兩條明顯條帶并且基本沒有其它雜帶，表明得到了純度較高的IgG，結果如圖5所示。ECL曝光法（圖6）顯示，抗血清能夠正確的與56 kDa大小的BBS2蛋白特異結合，證明所制備的多克隆抗體具有很好的特異性，可與免疫原專一性結合。

圖5 BBS2的抗體經Protein A純化Fig.5 Anti-BBS2 antiserum purified by Protein A

圖6 Western blotting驗證抗體特異性-ECL曝光法Fig.6 Antibody specificity detected by Western blotting through ECL method

2.6 免疫熒光法檢測BBS2的定位及抗體的活性

免疫熒光實驗檢測的是細胞內沒有發(fā)生變性的活性蛋白，對抗體特異性的要求更高，本實驗抗體制備所用免疫抗原為8 mol/L尿素處理后的變性蛋白，為了進一步確定其產生的抗體是否具有生物活性，特對其進行免疫熒光實驗。結果如圖7所示，可以看到BBS2的抗體能夠與萊茵衣藻BBS2蛋白特異性結合，且結合處主要位于纖毛的基體，表明BBS2蛋白主要定位在纖毛基體，少部分沿纖毛呈點狀分布，與IFT復合物的定位結果相一致。

圖7 免疫熒光檢測BBS2蛋白在萊茵衣藻纖毛中的定位Fig.7 Immun of luorescence analysis the flagella localization of BBS2

3 討論

為了研究BBsome在纖毛中的裝配機制，本文制備了在萊茵衣藻中的高特異性和高靈敏度的BBS2抗體。首先在大腸桿菌中經IPTG誘導大量表達BBS2，然后用多步純化獲得高純度的6×His-BBS2融合蛋白，并作為抗原免疫新西蘭大白兔獲得抗血清。雖然本研究使用的是bbs2基因的N端的133個氨基酸序列，且其在大腸桿菌中表達后主要以包涵體的形式存在，但使用尿素溶解進行純化后能得到高純度的蛋白，通過ECL曝光的方法檢測了所制備多克隆抗體的特異性和靈敏度，獲得的抗血清經過親和純化后所得抗體的特異性和靈敏度極高。在本實驗中，使用6×His作為純化標簽是抗體特異性高的一個有利條件，由于其只有6個組氨酸構成，分子量較小，在動物機體中引起的免疫反應較一些分子量大的標簽要小一些，產生的抗體特異性也會更高一些。其次，抗原的好壞與抗原決定簇有關，大部分抗原決定簇是親水性的，且許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域的，因此，一般來說蛋白質的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。使用bbs2基因N端的133個氨基酸序列，雖然其表達后呈水不溶性，但經序列分析后發(fā)現其親水性相比較其它位置序列仍然較高。同時，水不溶性的抗原在純化過程中一直處于高濃度尿素中，使其充分變性溶解才能進行后續(xù)的親和純化，因而得到比較單一的純化后蛋白作為免疫抗原進行后續(xù)實驗，也是最終抗體制備成功的關鍵因素。此外，本實驗所制備的BBS2抗體可以很好地用于免疫熒光實驗，實驗結果顯示BBS2抗體能夠專一性地與萊茵衣藻BBS2蛋白結合，且發(fā)現BBS2蛋白主要定位在纖毛基體，極少部分沿纖毛呈點狀分布，與文獻[6]結果一致。該部分結果表明BBS2與BBS4在纖毛中的分布一致是BBSome的一個組分。該抗體對進一步研究BBS2蛋白在纖毛的形成、與其他IFT蛋白的相互作用及BBS等纖毛病的發(fā)病機理都具有重要的意義。目前，不可溶蛋白作為抗原進行多克隆抗體制備仍然沒有固定的規(guī)律遵循，其因蛋白性質的不同而千差萬別。

4 結 語

本研究成功制備出萊茵衣藻BBS2蛋白多克隆抗體，并具有較高的效價和強特異性，將對BBS2及BBSome蛋白復合物在纖毛裝配及組裝的研究奠定基礎。