不對稱還原苯丙酮酸的L-乳酸脫氫酶L-LcLDH2的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

李雪晴， 袁風(fēng)嬌， 劉 艷， 李劍芳， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

手性α-羥基酸是合成許多藥物、化學(xué)材料的重要前體物質(zhì)[1-2]。例如，苯乳酸（Phenyllacticacid，PLA）又名2-羥基-3苯基丙酸，存在兩種對映異構(gòu)體，D-PLA和L-PLA。D/L-PLA均具有廣譜且高效的抑菌活性，是一種新型天然生物防腐劑[3]，可作為飼料添加劑替代畜禽飼料的抗菌劑[4-5]。

L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，L-LDH，EC 1.1.1.27），是脫氫酶中十分重要且研究較多的一種酶，也是生物體內(nèi)糖酵解途徑中一種關(guān)鍵的氧化還原酶。已有研究發(fā)現(xiàn)多種L-LDH可不對稱還原苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）生成 PLA，如嗜熱脂肪地 芽孢桿菌 （Geobacillus stearothermophilus）的bsLDH[6]，副干酪乳桿菌（lactobacillus paracasei）的L-LDH[7]和凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）NL01的L-nLDH[8]等。但是不同的L-LDH不對稱還原PPA的能力存在明顯差異，如賈江花等[9]克隆了來源于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）中的L1-LDH和L2-LDH基因，并在大腸桿菌（Escherichia coli）中實現(xiàn)了表達(dá)，重組L1-LDH對PPA的比活性為71.06 U/mg，而重組L2-LDH對PPA的比活性為0.06 U/mg。來源不同的L-LDH對PPA的活性差異更加明顯，如王穎[10]等將來源于巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium Z2013513）L-LDH酶基因在E.coli中實現(xiàn)了表達(dá)，重組L-LDH粗酶液的酶活性僅為3.4 U/mg。因此，利用分子生物學(xué)手段不斷挖掘出性狀優(yōu)良的L-LDH，仍然是目前研究發(fā)展的趨勢。

本研究以干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei CICIMB1192）基因組為模板，通過PCR擴增出一種編碼 L-乳酸脫氫酶（L-LcLDH2）的基因 Lcldh2，并借助 pET-28a（+）將 Lcldh2 在 E.coli BL21（DE3）中實施異源表達(dá)。采用表達(dá)L-LcLDH2的E.coli/Lcldh2全細(xì)胞催化PPA，測定PLA的產(chǎn)量與對映體純度。以PPA為底物，測定重組L-LcLDH2粗酶液的酶活性。最后，借助生物信息學(xué)軟件分析L-LcLDH2的理化性質(zhì)和功能特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基 克隆質(zhì)粒pUCm-T購自 Sangon上海公司；表達(dá)質(zhì)粒 pET28a（+）、L.casei CICIMB1192、E.coli JM109 和 E.coli BL21（DE3）由作者所在實驗室保藏；MRS培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸錳 0.25 g/L、乙酸鈉 5 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、磷酸氫二鉀 2 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、吐溫80 1 mL，調(diào)pH至6.2。LB液（固）體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L 瓊脂粉。

1.1.2 主要試劑和儀器 rTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa大連公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、250 bp ladder marker和低相對分子質(zhì)量protein marker購自Sangon上海公司；PPA購自Sigma-Aldrich美國公司；D/L-PLA和L-PLA購自安耐吉化學(xué)上海公司；NADH購自百靈威上海公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。液相色譜儀Waters-2695和紫外檢測器Waters-2489購自Waters美國公司；液相色譜柱ProntoSIL C18（150 mm×4.6 mm × 0.25 μm）購自德國Bischoff公司，手性液相色譜柱OD-H（250 mm×4.6 mm ×5 μm）購自大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 搜索出NCBI公布的L.casei基因組中的L-LcLDH2氨基酸序列（KTE98134），根據(jù)其對應(yīng)的核苷酸序列，設(shè)計一對擴增Lcldh2的特異性PCR引物，委托上海Sangon公司合成。

Ldh-F:5′-CATATGATGGCAAGAACAATTGG T-3′下劃線部分為NdeⅠ酶切位點

Ldh-R:5′-CTCGAGCTTCATTTTTTCAAAGGT ATC-3′下劃線部分為XhoⅠ酶切位點

1.2.2 L-LcLDH2基因的克隆 挑取L.casei CICIMB1192單菌落于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，取1.4 mL菌液用于總DNA提取[11]。以此總DNA為模板，Ldh-F和Ldh-R為引物，進(jìn)行PCR:94℃預(yù)變性4 min，30個循環(huán) （94℃ 30 s、53 ℃ 30 s和 72 ℃ 60 s），72℃充分延伸 10 min。將純化的目的PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接獲重組質(zhì)粒pUCm-T-Lcldh2，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選和DNA測序。將測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，割膠回收Lcldh2，與經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a（+）連接，獲重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a（+）-Lcldh2，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3），DNA 測序驗證。

1.2.3 L-LcLDH2的誘導(dǎo)表達(dá) 測序正確的轉(zhuǎn)化子命名為 E.coli/Lcldh2，而僅含 pET-28a（+）轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/pET-28a。分別挑取E.coli/Lcldh2和E.coli/pET-28a單菌落接種于2 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。以2 g/dL的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的100mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6~0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG溶液，16℃誘導(dǎo)10 h。8 000 r/min、5 min離心收集菌體，經(jīng)磷酸鈉鹽緩沖液（Na2HPO4/NaH2PO4、100 mmol/L、pH 7.0）洗滌 2 次后制備含100 mg/mL濕細(xì)胞的菌懸液，用于SDS-PAGE電泳分析及后續(xù)研究。另取一定量含50 mg/mL濕細(xì)胞的菌懸液，超聲破碎后，4℃，12 000 r/min，離心10 min后取上清液即為粗酶液。采用Bradford法[12]測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 L-LcLDH2酶活性的測定 L-LcLDH2的酶活性測定方法:總反應(yīng)體系包括50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L PPA，對照組中不含NADH，其他成分相同?；靹蚝笥?0℃保溫5min，加入適量的酶液。檢測NADH在340nm處吸收值的變化。酶活力單位（U）定義為:在上述條件下，每分鐘催化氧化1 μmol NADH所需要的酶量。比活性定義為每毫克酶蛋白所含的酶活單位數(shù)（U/mg）。

1.2.5 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA生成PLA 于1 mL離心管中加入300 μL菌懸液和250 μL磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），37 ℃保溫 5 min，再依次加入 50 μL 葡萄糖（終濃度 50 mmol/L）和 400 μL PPA（終濃度 10 mmol/L），反應(yīng)1 h后，取200 μL反應(yīng)液加入800 μL甲醇終止反應(yīng)，過0.22 μm有機濾膜。按照方法1.2.6進(jìn)行HPLC分析；另取200 μL反應(yīng)液，用1 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，上層有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過0.22 μm有機濾膜，按照方法1.2.6進(jìn)行對映選擇性分析。

1.2.6 HPLC分析PPA和PLA 采用反相HPLC分析PPA及PLA，色譜柱為ProntoSILC18（150 mm×4.6 mm×0.25 μm），分析條件:流動相為體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸/水 （A）和體積分?jǐn)?shù)0.05% 三氟乙酸/甲醇（B）混合液，梯度洗脫程序為（體積分?jǐn)?shù)）:0～15 min 20%～65%B；15～16 min 65%～100%B；16～19 min保持 100%B，紫外檢測器，柱溫 30℃，流速1 mL/min。檢測波長為210 nm，PPA和PLA的保留時間依次為11.372 min，12.858 min。

采用正相HPLC進(jìn)行手性分析[13]，色譜柱為Daicel OD-H（250 mm×4.6 mm×5 μm），分析條件:流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸（98∶2∶0.05，體積比），紫外檢測器，柱溫30℃，流速1mL/min，檢測波長為210 nm，D-PLA和L-PLA的保留時間依次為33.896 min，35.806 min。依據(jù)峰面積計算L-PLA的eep=[LPLA-D-PLA/（L-PLA+D-PLA）]× 100%。

1.2.7 L-LcLDH2的生物信息學(xué)分析 運用表1列出的軟件和程序分析L-LcLDH2的理化性質(zhì)和功能特性。

表1 序列分析工具Table 1 Tools applied for sequence analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 L-LcLDH2編碼基因Lcldh2的克隆

以L.casei基因組為模板，按1.2.2方法進(jìn)行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果在1 000 bp下方出現(xiàn)一特異性條帶，大小與預(yù)期基本相符（見圖1）。將其克隆至pUCm-T獲重組質(zhì)粒pUCm-TLcldh2。DNA測序結(jié)果顯示，Lcldh2開放閱讀框長906 bp，編碼301個氨基酸。Lcldh2與模板的同源性為99.45%，Lcldh2的核苷酸序列中第181位由模板對應(yīng)的G變?yōu)锳，其氨基酸序列中第61位點的氨基酸殘基由模板對應(yīng)的Val變?yōu)镮le。

圖1 Lcldh2的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Lcldh2

2.2 L-LcLDH2的誘導(dǎo)表達(dá)

按1.2.4方法將E.coli/pET-28a和E.coli/Lcldh2進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的E.coli/Lcldh2全細(xì)胞約在相對分子質(zhì)量33.5×103（表觀相對分子量）處有一明顯的特異性蛋白質(zhì)條帶（圖2，泳道2），而E.coli/pET-28a在此處無特異性蛋白質(zhì)條帶（圖2，泳道1），表明Lcldh2在E.coli BL21（DE3）中成功實現(xiàn)了異源表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)-LcLDH2的粗酶液催化PPA的酶活性為47 U/mg，顯著高于來源于Bacillus megaterium Z2013513的重組 L-LDH 的酶活性（3.4 U/mg）[10]。

2.3 全細(xì)胞催化PPA生成L-PLA

按照1.2.6方法，測定了E.coli/Lcldh2和E.coli/pET-28a全細(xì)胞在1 h催化10 mmol/L PPA后生成PLA的濃度。在37℃、220 r/min條件下，10 mmol/L PPA經(jīng)30 mg/mL E.coli/Lcldh2全細(xì)胞轉(zhuǎn)化1 h后，生成3.5 mmol/L的PLA，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為35%，而不含Lcldh2的E.coli/pET-28a催化PPA生成PLA的濃度僅為0.07 mmol/L，即含Lcldh2的重組菌轉(zhuǎn)化PPA生成PLA的量比宿主菌提高了49倍。產(chǎn)物的手性分析結(jié)果顯示，L-PLA的eep＞99%，表明L-LcLDH2具有很高的對映選擇性。

圖2 重組E.coli全細(xì)胞的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis ofthe whole cellof recombinant E.coli

另外，反相液相檢測結(jié)果分析表明，全細(xì)胞催化PPA生成L-PLA的同時產(chǎn)生了一定量的副產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)譜檢測確定該副產(chǎn)物為苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）。 微生物代謝途徑中 Phe可在轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為PPA，該反應(yīng)為可逆反應(yīng)。因此在E.coli/Lcldh2全細(xì)胞催化PPA生成PLA的反應(yīng)中，E.coli自身攜有的轉(zhuǎn)氨酶可轉(zhuǎn)化少量的PPA生成Phe。

2.4 L-LcLDH2的生物信息學(xué)分析

2.4.1 L-LcLDH2的一級結(jié)構(gòu)分析 按照1.2.7方法預(yù)測了L-LcLDH2的理化特性和功能特性，結(jié)果顯示，L-LcLDH2的分子式為C1451H2296N388O447S8，理論相對分子質(zhì)量為32 585，理論等電點為5.5，平均親水系數(shù)為-0.117，表現(xiàn)出強親水性，不穩(wěn)定指數(shù)為11.87，是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)，無信號肽和跨膜區(qū)域，由此推測L-LcLDH2是一種非分泌型、非跨膜蛋白，保留在細(xì)胞質(zhì)中，直接參與物質(zhì)代謝。

運用ClustalW2和ESPript 3.0對L-LcLDH2與4種不同的L-LDH進(jìn)行了多序列比對及保守序列和催化活性位點的分析（圖3）。L-LcLDH2與L.rhamnosus L-LDH，L.perolens L-HicLDH，L.composti L-HicLDH，L.confuses L-HicLDH的同源性分別為92%、64%、53%、43%。如圖3所示，L-LcLDH2存在典型的NAD+結(jié)合位點序列（GXGXXG，X-任意氨基酸）。L-LcLDH2的底物識別位點為Thr223，催化活性位點為 Arg89、Asp148、Arg151和 His176。 另外，Asp34是NAD+結(jié)構(gòu)域中決定L-LDH的輔酶為NADH而不是NADPH的關(guān)鍵氨基酸，因此，L-LcLDH2是一種 NADH依賴型L-LDH。

圖3 L-LcLDH2與其他來源的L-LDHs的多序列比對和保守區(qū)域分析Fig.3 Alignment of multiple sequences and analysis of conserved motifs of L-LcLDH2 with other L-LDHs

2.4.2 L-LcLDH2的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和三維結(jié)構(gòu)的同源建模 運用SOPMA預(yù)測L-LcLDH2的二級結(jié)構(gòu)顯示，L-LcLDH2含有 40.2%的 α-螺旋，19.93%的延伸鏈，7.97%的β-轉(zhuǎn)角和31.89%的無規(guī)則卷曲。運用SWISS-MODEL和PyMOL對L-LcLDH2的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源建模和分析（圖3）。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索出了與L-LcLDH2同源性為43%的來源于融合乳桿菌（L.confuses）的L-2-羥異己酸脫氫酶（L-2-Hydroxyisocaproate Dehydrogenase，L-HicDH，PDB:1HYH）晶體結(jié)構(gòu)?；贚-HicDH結(jié)構(gòu)與功能的研究[14]，推測L-LcLDH2由α螺旋和β折疊形成的NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要由6個β折疊和5個α螺旋組成，而催化結(jié)構(gòu)域主要由6個β折疊和4個α螺旋組成。已有研究表明[15]，L-LcLDH2的催化活性位點高度保守，活性中心由 Arg89、Asp148、Arg151和 His176組成。當(dāng)α-羰基酸與酶結(jié)合時，Arg151的胍基結(jié)合到底物的羧基形成一個穩(wěn)定的鹽橋[16]，Arg89的胍基和His176的咪唑基共同與底物的α-羰基結(jié)合，其中His176提供質(zhì)子，而Asp148穩(wěn)定去質(zhì)子化的His176，這些位點共同催化α-羰基酸上的α-羰基還原成羥基生成α-羥基酸[6]。

3 結(jié) 語

L-LDH在生物催化過程中具有重要的應(yīng)用價值，通過基因工程實現(xiàn)L-LDH異源高效表達(dá)是降低其工業(yè)應(yīng)用成本、適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用的有效手段[17]。本研究從L.casei CICIMB1192基因組中成功克隆了一種編碼L-LcLDH2的基因Lcldh2并實現(xiàn)了該基因在 E.coli BL21（DE3）中的異源表達(dá)，L-LcLDH2 的催化活性位點為 Arg89、Asp148、Arg151和 His176，具有典型NAD+結(jié)合位點序列，是一種NAD依賴型LLDH。采用E.coli/Lcldh2全細(xì)胞不對稱還原PPA，可生成高光學(xué)純度L-PLA。本研究為生物催化法制備手性L-PLA提供了新的工具酶，也為進(jìn)一步利用該酶生產(chǎn)L-PLA提供了理論支持。

圖4 L-LcLDH2的三維結(jié)構(gòu)和催化活性位點Fig.4 Three-dimensional structure and catalytic sitesof L-LcLDH2