草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷對肝癌細胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

崔香丹， 鄭 峰， 朱潔波， 全吉淑， 尹學哲*

（1.延邊大學 附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學 醫(yī)學院，吉林 延吉 133000）

如今，原發(fā)性肝細胞癌（HCC）的新發(fā)呈迅猛的增加趨勢[1]，WHO揭曉的《全球癌癥報告》表明，肝癌的新發(fā)和死亡人數(shù)中國居世界第一[2]。惡性腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡、增殖緊密相關(guān)[3]。細胞凋亡是由基因調(diào)控引起的細胞環(huán)境和死亡信號變化引起的程序性細胞死亡過程。腫瘤細胞與實體腫瘤中都存在細胞凋亡，且凋亡程度的好壞直接與腫瘤的發(fā)展程度相關(guān)。

草蓯蓉為中國傳統(tǒng)的民族藥，為我國二類保護植物，是大興安嶺高山地區(qū)、長白山特有植物[4]。草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷（Iridoid glycosides from Boschniakia rossica，IGBR）是草蓯蓉重要活性成分，具有抑制腫瘤、誘導凋亡、抗氧化、保肝等作用[5-6]。目前對IGBR抗癌機制方面的研究受到廣泛的關(guān)注。探討二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)大鼠肝癌中IGBR對細胞凋亡及細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的作用，進一步闡明其抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠購自延邊大學實驗動物中心，Bax、Bcl-2多克隆抗體、TUNEL和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋，IGBR為延邊大學基礎醫(yī)學院全吉淑教授惠贈。

1.2 肝癌大鼠模型的制備

Wistar雄性大鼠148只，分為對照組、模型組、5-FU組及IGBR組。對照組大鼠第1天給予腹腔注射1次0.1 mL/hg生理鹽水；余3組大鼠第1天腹腔注射1次200 mg/kg DEN，然后給予飲用體積分數(shù)0.05%的DEN水溶液。5-FU組大鼠腹腔注射25 mg/kg 5-FU每周3次；IGBR組大鼠灌胃500 mg/kg IGBR每日1次。實驗第12、20周末處死6只動物，第28周末處死24只動物，取心臟血，肝臟福爾馬林固定。

1.3 檢測方法

HE染色觀測肝臟病理變化，TUNEL法檢測肝細胞的凋亡，免疫組化法檢測Bax和Bcl-2的表達。每張切片中陽性細胞率＜5%為陰性（-）；5%～25%為弱陽性（+）；25%～50%為中等強度陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學處理

利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以X±s表示，計數(shù)資料以X2檢驗和Spearman等級相關(guān)檢驗表示，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織病理學改變

2.1.1 HE染色 對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列正常。模型組病理變化可分為3個階段。1）肝炎階段（12周）:可見炎性反應、壞死和淋巴細胞浸潤、膠原沉積及凋亡小體。2）肝硬化階段（20周）:可見結(jié)節(jié)性肝細胞再生，不同大小的肝結(jié)節(jié)，肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞、肝索排列紊亂。3）肝癌階段（28周）:可見肝細胞核深染，肝細胞變性、增生，部分可見癌細胞增生。5-FU組及IGBR組病理變化較模型組明顯改善，但兩組間無明顯差異。

2.1.2 肝細胞凋亡染色 對照組大鼠肝細胞凋亡稀少，著色淺。與對照組比較，模型組細胞凋亡顯著增加，胞質(zhì)呈棕黃色，凋亡的肝細胞固縮、核濃縮、核仁消失，差異有統(tǒng)計學意義（X2=11.510，P＜0.01）。與模型組比較，5-FU組與IGBR組凋亡明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義 （5-FU組X2=11.147，IGBR組X2=7.813；P＜0.05），但兩組間無顯著差異（X2=2.424，P＞0.05），（見表 1 和圖 1）。

圖1 肝組織TUNEL及Bax、Bcl-2免疫組化觀察結(jié)果(×100)Fig.1 Observation of TUNE and Immunohistochemical observation of Bax,Bcl-2of liver sections(×100)

表1 肝細胞凋亡檢測及Bax、Bcl-2在各組大鼠肝組織中的表達情況Table 1 Apoptosis of liver cells and the expression of Bax and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化染色結(jié)果

Bax和Bcl-2陽性細胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中，表達于胞漿（見表1，圖1）。與對照組比較，模型組Bax和Bcl-2表達明顯增強（Bax X2=15.607，Bcl-2 X2=6.276；P＜0.05）；與模型組比較，5-FU組和IGBR組Bax表達明顯增強，而Bcl-2表達明顯減弱 （5-FU組Bax X2=9.202，IGBR組Bax X2=7.895；5-FU 組 Bcl-2 X2=7.719，IGBR 組 Bcl-2 X2=6.907；P＜0.05），兩組間無顯著差異（Bax X2=0.956，Bcl-2 X2=2.827；P＞0.05）。

2.3 各組大鼠肝組織Bax與Bcl-2之間的相關(guān)性

Bax表達與Bcl-2表達，對照組無相關(guān)性（r=-0.090，P＞0.05），模型組呈負相關(guān) （r=-0.302，P＜0.05），5-FU 組呈負相關(guān) （r=-0.844，P＜0.05），IGBR組呈負相關(guān)（r=-0.766，P＜0.05）。

3 討 論

DEN誘發(fā)的大鼠肝癌多為肝細胞肝癌，造模簡單易成功。研究表明，DEN誘癌整個過程與人類肝細胞癌進程相似[6]。DEN在致癌過程中損傷肝細胞正常結(jié)構(gòu)，使肝細胞代償性增生。隨著給藥時間的延長，DEN在體內(nèi)的毒性堆積，可啟動癌變機制，肝組織病變程度也逐漸加重，引起大鼠的中毒反應，并導致肝癌的形成。本實驗用DEN誘發(fā)大鼠肝癌過程中發(fā)現(xiàn)，造模第28周時HE染色結(jié)果顯示肝細胞核大、深染、變性、異型增生，可見癌變細胞，成功地誘發(fā)了肝癌模型。與模型組相比，IGBR組和5-FU組病理變化均減輕，表明IGBR阻止了DEN的致癌進程，保護了肝組織。

肝癌的發(fā)生機制非常復雜，與細胞的增殖和凋亡發(fā)生異常相關(guān)。細胞凋亡是細胞的程序性死亡，能調(diào)控機體發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[6-7]。研發(fā)及評估抗腫瘤藥物的重要指標與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關(guān)[8-9]。有大量的研究表明，抗凋亡因子在腫瘤細胞株和實體腫瘤中表達增加，使正常的凋亡程序受到抑制，而增殖能力不斷增強[10]。

細胞凋亡的發(fā)生受多種基因的調(diào)控，其中Bax和Bcl-2備受關(guān)注，且其比值決定細胞接受凋亡信號后存活與否，在調(diào)控凋亡中起關(guān)鍵作用[11-13]。正常情況下，Bax和Bcl-2的相互調(diào)節(jié)處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。當誘發(fā)癌變時，Bax/Bcl-2表達失衡可加重癌變的進展。大量研究表明，中草藥對細胞的凋亡有不同程度的誘導效果，輔助或協(xié)同細胞毒藥物對癌細胞起殺傷作用，其作用機制與凋亡相關(guān)蛋白的表達失衡相關(guān)[14]。

Bax為凋亡促進蛋白，Bcl-2為凋亡抑制蛋白，細胞中Bax升高則形成Bax同源二聚體，加速凋亡；反之形成Bax/Bcl-2異源二聚體，而抑制凋亡[15-16]。研究報道，肝癌和許多腫瘤細胞凋亡的增加，與Bax/Bcl-2表達失衡有關(guān)[17-20]。抑制凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比例高低，反映出細胞凋亡的能力大小[21]。

4 結(jié)語

本實驗中除對照組，細胞凋亡均明顯增多。5-FU與IGBR干預后，上調(diào)肝癌組織中Bax基因表達，而下調(diào)Bcl-2基因表達，并且Bax/Bcl-2比例也隨之升高，表明IGBR可使癌變的細胞發(fā)生凋亡，進而抑制肝癌的進展。IGBR可誘發(fā)細胞凋亡，抑制肝癌細胞增值，其機制可能與Bax蛋白增多和Bcl-2蛋白減少有關(guān)。