蝙蝠蛾擬青霉治療1型糖尿病活性研究

高 寒， 趙 毅， 胡馨予， 鄭德慶

（1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，吉林 長春 130061；3.沐石河鎮(zhèn)中心校，吉林 長春 130508））

糖尿病是威脅人類健康的重大代謝類疾病之一，是一類由胰島素分泌不足或作用障礙導(dǎo)致的慢性代謝疾病，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致周圍組織對胰島素的耐受性增高，胰腺組織損傷，進而引起機體脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[1]。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化及肥胖發(fā)病率的增加，糖尿病發(fā)病趨勢呈逐年上升的趨勢[2]。據(jù)統(tǒng)計，2013年，全球糖尿病患者人數(shù)為3 800萬，到2035年，將會有5 900萬人罹患糖尿病[3]。目前對糖尿病的治療多停留在對血糖的控制方面，通過長期服用藥物保持血糖的穩(wěn)定，例如注射胰島素、口服降血糖藥物等，但長期的藥物治療不僅給機體帶來副作用，更增加患者的經(jīng)濟和心里壓力，給患者及家庭帶來巨大的痛苦。因此開發(fā)新型治療糖尿病的中藥制劑或探究新的藥用真菌顯得額外重要，應(yīng)用前景巨大。

冬蟲夏草是我國珍貴野生藥用資源，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、免疫增強等活性[4]。蝙蝠蛾擬青霉為野生冬蟲夏草中分離得到的內(nèi)寄生菌，具有顯著的抗腫瘤及腎炎保護活性[5-6]。本研究將采用腹腔注射鏈佐脲菌素方法建立1型糖尿病大鼠模型，考察蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體（PH）對糖尿病模型大鼠血糖水平的調(diào)節(jié)作用，并初步闡明其對降血糖活性作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性 Sprague Dawley 大鼠，180~220 g，6~8 周齡，SPF級，購買自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。動物許可證號:SCXK（遼）-2015-0001。

1.2 實驗儀器

pHs-2c精密酸度計，上海第三儀器分析廠制造；GSY-II恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠制造；752紫外可見分光光度計，上海分析儀器廠制造；CentrifuGe 5810R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；ELX800酶標(biāo)儀，BIOTEK產(chǎn)品；輪轉(zhuǎn)切片機，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠制造；TE2000倒置式生物顯微鏡，日本尼康產(chǎn)品。

1.3 實驗試劑及配制

蝙蝠蛾擬青霉經(jīng)蝙蝠蛾擬青霉RCEF1429（購買于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)菌株保藏中心），誘變得到，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體由本實驗室液體發(fā)酵獲得，經(jīng)過真空冷凍干燥，制成蝙蝠蛾擬青霉菌粉待用，經(jīng)檢測其中多糖質(zhì)量分數(shù)4.38%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)10.52%，腺苷質(zhì)量分數(shù)0.24%，氨基酸質(zhì)量分數(shù)15.26%，蟲草素質(zhì)量分數(shù)6.32%。

STZ（Streptozotocin），購于上海源葉生物試劑有限公司；鹽酸二甲雙胍片，購買自北京京豐制藥有限公司；二甲苯、無水乙醇、石蠟、液體石蠟等，購買自國藥集團。

實驗檢測試劑盒:RAT INS ELISA KIT，購買自上海源葉生物試劑有限公司。

糖原檢測試劑盒（肝糖原/肌糖原）、SOD測定試劑盒、GSH-Px測定試劑盒、糖化血紅蛋白檢測試劑盒、HE染色試劑盒，均購買自南京建成生物公司。

0.1 mol/L，pH 4.5的檸檬酸緩沖液的配制:（A）準(zhǔn)確稱量21.01 g檸檬酸，溶于1 L蒸餾水；（B）準(zhǔn)確稱取29.41 g檸檬酸三鈉，溶于1 L蒸餾水；取A液280 mL與220 mL B液混合，蒸餾水定溶至1 L，備用。

STZ溶液的配制:準(zhǔn)確稱取STZ粉末，避光狀態(tài)下溶解于上述配制好的檸檬酸緩沖液中，置于冰浴中，配制完畢后需在30 min內(nèi)注射完畢。

1.4 實驗方法

1.4.1 1型糖尿病大鼠模型的建立[7]大鼠適用性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水16 h，采用腹腔注射預(yù)冷的STZ溶液，注射劑量為65 mg/kg。注射后4 h，大鼠灌胃給予2.5 g/kg葡萄糖溶液，72 h后，大鼠尾靜脈取血，測定大鼠空腹血糖值，血糖高于13.8 mmol/L為造模成功?？瞻讓φ战M大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液（pH 4.3）。大鼠灌胃給藥期間，每天更換新鮮用水，保證供水新鮮；每天更換墊料，保證生活環(huán)境的清潔；飼養(yǎng)室溫度保持為 （22±1）℃；濕度為50%～65%，晝夜時間為12 h/12 h（日照時間為7:00～19:00）。

1.4.2 大鼠分組及給藥 將建模成功大鼠隨機分為模型組（Model，灌胃5 mL/kg 0.5 g/mL羧甲基纖維素鈉溶液）、陽性對照組（Met，灌胃0.12 g/kg鹽酸二甲雙胍）、低劑量組（PH（L），灌胃 1.0 g/kg 蝙蝠蛾擬青霉菌粉溶液）、高劑量組（PH（H），灌胃2.0 g/kg蝙蝠蛾擬青霉菌粉溶液）、空白對照組給予等量生理鹽水。每組10只，保證大鼠每天灌胃時間基本相同，灌胃期間，大鼠每周稱重，測定空腹血糖值。

1.4.3 樣品收集 大鼠給藥4周后，禁食不禁水12h，大鼠心臟取血，收集血漿及紅細胞，按照相應(yīng)試劑盒說明書檢測大鼠胰島素、糖化血紅蛋白、SOD、GSH-Px水平。

大鼠脫頸處死，快速收集大鼠肝臟及肌肉組織，檢測大鼠肝糖原、肌糖原水平。

1.4.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 收集大鼠腎臟及胰島組織，采用4 g/mL多聚甲醛固定，4℃保存。常規(guī)石蠟包埋、切片。采用HE染色，光鏡觀察進行病理分析。1.4.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果采用均值±SD（）方法表示，采用SPSS16.0軟件進行檢測，以P＜0.05作為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PH對糖尿病大鼠血糖及體質(zhì)量的影響

實驗過程中，大鼠體質(zhì)量變化如表1所示，大鼠建模一周后，與CTRL相比，Model組大鼠體質(zhì)量顯著降低（（228.1±17.2） g vs （268.8±7.3） g，P＜0.01）。大鼠給藥4周后，與Model組相比，各治療組大鼠體質(zhì)量均顯著增加（P＜0.01）。表明PH對糖尿病大鼠體質(zhì)量具有很好的恢復(fù)作用，且其恢復(fù)程度與鹽酸二甲雙胍相近。

表1 蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響（，n=10）Table 1 Effects of Paecilomyces hepiali on body weight of diabetic rats（，n=10） g

表1 蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響（，n=10）Table 1 Effects of Paecilomyces hepiali on body weight of diabetic rats（，n=10） g

注:與空白組相比，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

時間第0周第1周第2周第3周第4周CTRL 247.6±7.8 268.8±7.3 290.8±11.8 309.7±17.3 351.4±20.3 Model 239.6±7.5 228.1±17.2##213.5±20.4###219.7±20.1###221.7±20.1###Met 254.8±10.3 232.1±12.2 229.7±14.5 250.4±19.4**273.3±17.3**PH(L)246.4±5.8 219.2±15.8 215.7±13.0 239.6±17.4*258.4±19.4**PH(H)245.4±8.8 222.6±11.8 232.4±16.7 253.3±17.3**289.4±14.8**

大鼠血糖變化如表2所示。血糖是細胞組織能量供應(yīng)的主要物質(zhì)，長期的高血糖是診斷糖尿病的最直觀指標(biāo)。在本實驗中，STZ注射一周后，大鼠血糖值顯著增加（（17.3±1.9） vs （4.5±0.9），P＜0.01），在大鼠給藥期間，Model組大鼠血糖值穩(wěn)定，均顯著高于13.8 mmol/L，證明實驗?zāi)Ｐ途哂泻芎玫姆€(wěn)定性，數(shù)據(jù)可靠。大鼠給藥4周后，與Model組相比，各給藥組大鼠空腹血糖均有降低（P＜0.05），其中Met治療組、PH （H）治療組大鼠血糖水平顯著下降 （P＜0.01），提示蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有顯著的降血糖活性。

表2 蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠血糖的影響n=10）Table 2 Effect of Paecilomyces hepiali on blood glucose of diabetic ratsn=10）

表2 蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠血糖的影響n=10）Table 2 Effect of Paecilomyces hepiali on blood glucose of diabetic ratsn=10）

注:與空白組相比，###P＜0.001；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

時間第0周第1周第2周第3周第4周CTRL 4.6±0.8 4.5±0.9 4.9±0.9 4.7±0.7 4.4±1.1 Model 4.5±0.6 17.3±1.9###20.6±7.0###19.5±6.5###18.8±4.6###Met 4.5±0.8 17.4±3.5 17.5±2.4 15.3±2.2*12.4±2.1**PH(L)5.2±1.1 17.0±5.1 18.5±3.9 16.8±1.7 13.6±5.1*PH(H)4.6±0.7 16.8±4.8 17.9±1.2 13.9±2.8**10.6±6.9**

2.2 PH對糖尿病大鼠血清胰島素水平的影響

實驗動物的血清胰島素水平見圖1，STZ能破壞胰島β細胞，降低大鼠的血清胰島素含量。結(jié)果顯示，Model組大鼠的胰島素水平顯著低于CTRL組大鼠（P＜0.01），同樣證明了STZ對大鼠胰島細胞的破壞作用。與Model組大鼠相比，給藥組大鼠血清胰島素水平均有不同程度的提升（P＜0.05），其中PH（H）治療組大鼠血清胰島素水平顯著增加 （P＜0.01）。以上的實驗結(jié)果提示PH的降血糖活性的機制可能是促進糖尿病大鼠胰島β細胞分泌胰島素，亦或是促進胰島β細胞的再生或修復(fù)。

圖1 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠胰島素水平的影響（，n=10）Fig.1 Effects of Paecilomyces hepiali on insulin of diabetic rats（，n=10）

2.3 PH對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白水平的影響

糖化血紅蛋白（HbA1c）是臨床上常用的反映血糖控制水平的一個重要指標(biāo)，結(jié)果如圖2所示。由結(jié)果可以看出，與空白大鼠相比，Model組大鼠糖化血紅蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組大鼠相比，Met和PH（H）均能顯著降低糖尿病大鼠糖化血紅蛋白含量（P＜0.05），說明PH的降糖活性與其促進糖原合成或抑制糖原分解有關(guān)，增加糖尿病大鼠糖的儲存能力，對糖尿病大鼠糖代謝具有一定的調(diào)節(jié)能力。

圖2 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠糖化血紅蛋白水平的影響 （n=10）Fig.2 Effects of Paecilomyces hepiali on the level of Glycated hemoglobin in diabetic rats（，n=10）

2.4 PH對糖尿病大鼠糖原水平的影響

圖3 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠肝糖原、肌糖原水平的影響n=10）Fig.3 Effects of Paecilomyces hepiali on liver glycogen，muscle glycogen of diabetic rats，n=10）

研究考察了PH對糖尿病大鼠糖原質(zhì)量分數(shù)的影響，結(jié)果如圖3所示。由結(jié)果可以看出，與空白大鼠相比，Model組大鼠肝糖原、肌糖原水平均明顯降低（P＜0.01）。Met和PH均能顯著提高糖尿病大鼠糖原水平（P＜0.05），說明PH的降糖活性與其促進糖原合成或抑制糖原分解有關(guān)，增加糖尿病大鼠糖的儲存能力，對糖尿病大鼠糖代謝具有一定的調(diào)節(jié)能力。

2.5 PH對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

氧化應(yīng)激被認為是與糖尿病有關(guān)并發(fā)癥的主要發(fā)病機理。在本研究中，檢測給藥4周后大鼠血清中SOD、GSH-Px的含量，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，與CTRL組大鼠相比，Model組大鼠血清SOD、GSH-Px 均顯著下降（P＜0.01，圖 4），說明 STZ導(dǎo)致糖尿病大鼠發(fā)生過氧化反應(yīng)，自身清除自由基能力下降，氧化應(yīng)激水平升高，而各給藥組大鼠SOD、 GSH-Px水平具有不同的提高（P＜0.05），推測藥物可能通過增加機體的抗氧化活性，減小機體氧化應(yīng)激，降低血糖。

圖4 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠SOD、GSH-Px水平的影響 s，n=10）Fig.4 Effects of Paecilomyces hepiali on SOD，GSH-Px of diabetic rats，n=10）

2.6 PH對糖尿病大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響

采用HE染色實驗考察PH對大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見圖5，可以看出，糖尿病大鼠腎臟組織發(fā)生明顯的病理學(xué)改變，腎小球肥大，基質(zhì)膜增厚，大量炎性細胞浸潤，腎小球細胞萎縮。與模型組相比，各給藥組大鼠腎臟病變均有明顯改善，腎小球結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎性細胞浸潤，證明蝙蝠蛾擬青霉菌絲體對糖尿病腎病具有很好的預(yù)防和治療作用。

圖5 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響（x±s，n=10）Fig.5 Effects of Paecilomyces hepialid on structures of kidney in diabetic rats（x±s，n=10）

2.7 PH對糖尿病大鼠胰島結(jié)構(gòu)的影響

采用HE染色實驗考察PH對大鼠胰島結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖6所示，可以看出，正常小鼠胰腺組織腺泡細胞包膜完整，胰島為圓形或卵圓形結(jié)構(gòu)，邊界清晰，且胰島團內(nèi)細胞較多，細胞質(zhì)豐富。與正常小鼠相比，糖尿病模型組小鼠胰島團內(nèi)細胞壞死明顯，數(shù)量減少，胰島結(jié)構(gòu)雜亂，小鼠給藥PH 4周后，胰島細胞出現(xiàn)再生現(xiàn)象，細胞排列整齊，胞質(zhì)豐富，PH（H）給藥組小鼠胰島組織恢復(fù)至正常水平。

2.8 討論

本章采用化學(xué)藥物STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病大鼠模型，考察蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體的調(diào)節(jié)血糖作用，并對其初步降血糖機制進行分析。實驗結(jié)果證明，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有顯著的降血糖活性，其活性可能是通過促進機體葡萄糖代謝，增加血糖合成及機體的抗氧化能力實現(xiàn)的。

胰島素是胰腺分泌的多肽類激素，是機體唯一負向調(diào)節(jié)血糖的激素，胰島素可刺激肝臟、肌肉、脂肪組織攝取和利用葡萄糖，抑制糖原的分解并阻止肝臟中糖異生和脂解作用。在本研究中，通過實驗結(jié)果推測，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體通過刺激胰島β細胞或調(diào)解機體內(nèi)外環(huán)境的平衡，保護、修復(fù)和改善胰島β細胞功能，促進胰島素分泌，增加血清胰島素含量而達到降血糖目的[8-10]。糖化血紅蛋白（HbA1）是一項非常重要的檢測指標(biāo)，HbA1主要包括 HbA1a、b、c，其中 HbA1c 是主要組成成分，最能確切反映血中葡萄糖特別是真糖水平的真實情況[11]，本研究發(fā)現(xiàn)，PH能夠顯著降低糖化血糖蛋白水平，可以預(yù)防油糖化血紅蛋白含量升高引起的糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，對糖尿病患者有重要意義。

圖6 蝙蝠蛾擬青霉對大鼠胰島結(jié)構(gòu)的影響n=10）Fig.6 Effects of Paecilomyces hepialid on structures of pancreas in diabetic ratsn=10）

氧化應(yīng)激被定義為機體自由基或者活性氧的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)的失衡。越來越多的實驗和臨床研究表明氧化應(yīng)激在糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)病過程中扮演重要角色[12]。糖尿病也通常與自由基或者受損的抗氧化系統(tǒng)的增加伴隨發(fā)生，二者相互影響。氧化應(yīng)激可損傷胰島β細胞、降低外周組織對胰島素的敏感性、抑制胰島素表達、合成與釋放等，是糖尿病發(fā)病機制中的一個重要原因。在糖尿病的發(fā)病過程中，長時間地高血糖水平也可以加重氧化應(yīng)激狀況，進而加重氧化應(yīng)激程度，更會惡化糖尿病的病情，導(dǎo)致多種并發(fā)癥的出現(xiàn)。因而，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)有望成為治療糖尿病的另一重要思路[13-14]。GSH-Px和SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，有效清除脂質(zhì)過氧化物、超氧自由基，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵菌絲體顯著增加糖尿病大鼠血清GSH-Px、SOD含量，增加機體抗氧化活性，保護機體組織免受氧化應(yīng)激損傷，進而降低機體血糖。大鼠腎臟及胰島組織病理學(xué)切片實驗結(jié)果顯示，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體對大鼠糖尿病腎病具有很好的預(yù)防和治療作用，同時能夠明顯減輕氧化應(yīng)激對糖尿病大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。

3 結(jié)語

通過STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，證明蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有顯著的降糖活性、抗氧化及預(yù)防糖尿病腎病活性，在糖尿病的預(yù)防和治療過程中具有重要作用。蝙蝠蛾擬青霉，是一種天然無毒的藥用真菌，為糖尿病的預(yù)防和治療提供了一種新的可靠的藥用資源。