裂解酶對食源性病原菌的生物防治研究及應(yīng)用

李隴平

（榆林學(xué)院 陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林719000)

病原菌污染食品，嚴(yán)重威脅到食品安全并危害人類健康，導(dǎo)致人類疾病甚至死亡，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這些致病菌主要包括李斯特菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、大腸埃希氏菌、梭狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等。噬菌體是自然界中數(shù)量最多的一類生物，經(jīng)過了數(shù)百萬年的進(jìn)化，它們能夠特異性識別和高效殺死細(xì)菌[1]。裂解酶是一種細(xì)菌肽聚糖水解酶，在噬菌體感染細(xì)菌后期，裂解酶被大量釋放出來，具有快速、高效裂解細(xì)菌肽聚糖層的特殊能力，使細(xì)菌破裂從而釋放子代噬菌體顆粒[1-2]。和革蘭氏陰性菌不同，革蘭氏陽性菌不存在肽聚糖之外的外膜結(jié)構(gòu)，所以，裂解酶從外加入時(shí)可以直接作用于革蘭氏陽性菌的肽聚糖，將其殺死。正因?yàn)槿绱?，噬菌體裂解酶在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)和食品安全等眾多領(lǐng)域都有所研究和應(yīng)用[3-6]。革蘭氏陽性菌噬菌體裂解酶結(jié)構(gòu)相似，一般由水解底物的催化活性域（Enzymatically Active Domains，EAD）和細(xì)胞壁結(jié)合域（Cell Wall-Binding Domains，CBD）構(gòu)成。 EAD 是裂解酶的核心部分，能夠特異性的識別肽聚糖層的化學(xué)鍵，根據(jù)它們在肽聚糖層作用的靶位點(diǎn)不同可以分為胞壁酸酶、葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)糖基酶、酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶。多數(shù)CBD能夠和細(xì)胞壁上的特殊配基特異性結(jié)合，引導(dǎo)EAD發(fā)揮裂解作用[2]。此外，裂解酶不僅能高效快速的殺滅多重耐藥細(xì)菌，而且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥性[3]。

本文作者將綜述裂解酶在檢測和防控食源性致病菌方面的研究進(jìn)展，同時(shí)，也將介紹裂解酶降解細(xì)菌生物膜和革蘭氏陰性菌的最新研究進(jìn)展。

1 裂解酶檢測食源性病原菌

噬菌體裂解酶CBD結(jié)構(gòu)域和配基的結(jié)合具有特異性，并且結(jié)合能力特別強(qiáng)，這些特點(diǎn)使裂解酶成為非常理想的細(xì)菌快速而又準(zhǔn)確的檢測 （診斷）工具。研究表明，李斯特菌噬菌體裂解酶對其靶位點(diǎn)的親和力甚至超過了用抗原抗體反應(yīng)檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性[7-8]。文獻(xiàn)[9]發(fā)明以裂解酶CBD為基礎(chǔ)的磁選法（CBD-Based Magnetic Separation，CBDMS），這種方法可以對不同李斯特菌進(jìn)行快速（時(shí)間控制在48 h內(nèi)，傳統(tǒng)方法至少需要96 h）、準(zhǔn)確（靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法）的檢測。CBD-MS的操作流程如下:1）采集樣品，包括蔬菜、奶牛和肉制品等；2）選擇性培養(yǎng)液對樣品中的目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行短期增殖（6~12 h）；3）將表面共價(jià)結(jié)合著不同李斯特菌噬菌體CBD結(jié)構(gòu)域的小磁珠加入到細(xì)菌培養(yǎng)液中，靜置幾分鐘，使磁珠能夠識別、結(jié)合不同血清型的細(xì)菌；4）用一塊磁鐵在試管外將吸附了細(xì)菌的磁珠聚集；5）倒掉培養(yǎng)液；6）水洗磁珠，并用緩沖液重懸；7）采用不同的方法檢測吸附在磁珠上的細(xì)菌:①分子生物學(xué)方法，PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR[10]；②直接在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)；③由于不同裂解酶能夠結(jié)合不同血清型細(xì)菌，可以將不同熒光標(biāo)記蛋白（Fluorescent Proteins，F(xiàn)P），如 GFP、CFP、和dsRed和CBD進(jìn)行融合表達(dá)，混合液中不同的CBD-FP可以使不同血清型李斯特菌的著色存在差異性，然后再通過用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測和區(qū)分不同血清型的李斯特菌[8]。類似CBD-MS的方法還應(yīng)用到其他革蘭氏陽性細(xì)菌，包括芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌[9]及炭疽桿菌[11]。需要指出的是，這些方法都只是針對革蘭氏陽性菌，由于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外面存在外膜結(jié)構(gòu)，使得噬菌體裂解酶無法穿過外膜層到達(dá)肽聚糖的配基位點(diǎn)發(fā)揮作用，因此，從外加入裂解酶時(shí)對革蘭氏陰性菌不起作用。

2 裂解酶控制食源性病原菌

食品生產(chǎn)和加工的各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能存在致病菌污染。所以，在食品生產(chǎn)加工諸多環(huán)節(jié)（生產(chǎn)、加工、包裝、分裝等），裂解酶都可以發(fā)揮控制病原菌感染的作用。表1是最近幾年來裂解酶作用于食源病原菌的一些主要研究實(shí)例。其中，一些裂解酶已經(jīng)在食品工業(yè)中得到了應(yīng)用，一些裂解酶雖然還未開始用于實(shí)踐，但是，它們在體外實(shí)驗(yàn)的研究中表現(xiàn)出非常獨(dú)特的裂解能力。

表1 裂解酶在控制食源性病原菌上的研究進(jìn)展Table 1 Bacteriophage lysins that have been tested against foodborne pathogens

續(xù)表1

2.1 裂解酶在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

裂解酶是一種蛋白質(zhì)，所以可以體外表達(dá)純化之后直接添加到食品中。文獻(xiàn)[14]首次報(bào)道噬菌體裂解酶lysH5能夠快速（4 h內(nèi)）、有效地殺死巴氏消毒牛奶中的金黃色葡萄球菌，并且LysH5和細(xì)菌素-乳酸鏈球菌肽表現(xiàn)出協(xié)同裂菌作用[12]。LysH5和其他肽聚糖水解酶及LysH5和溶葡萄球菌酶組成的嵌合體裂解酶對細(xì)菌的裂解活力也出現(xiàn)類似的協(xié)同作用[17-57]。CHAPSH3b是裂解酶HydH5肽鏈內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和溶葡萄球菌酶細(xì)胞壁結(jié)合域融合表達(dá)的嵌合體裂解酶，可以將牛奶中金黃色葡萄球菌的濃度在15 min內(nèi)降低到檢測水平以下，并且能夠在經(jīng)過巴氏滅菌消毒和4℃保存的奶制品中保持相當(dāng)高的活性[57]，因此，CHAPSH3b被作為奶制品保存的添加劑在使用。其他已經(jīng)報(bào)道的能夠在牛奶或者其他奶制品中發(fā)揮活性的噬菌體裂解酶或者嵌合體裂解酶包括梭狀芽胞桿菌噬菌體ΦCTP1裂解酶（奶酪生產(chǎn)中）[34]，鏈球菌噬菌體裂解酶Ply700[58]，λSA2[59]，B30[59-60]，λSA2-SH3b[32]和 Ply187AN-KSH3b[20]。LysZ5能有效殺死豆?jié){中的李斯特菌[47]。李斯特菌噬菌體裂解酶Ply511不僅具有廣譜裂菌活性（有效裂解不同血清型李斯特菌），而且90℃作用30 min仍然保持60%的裂解活性，表現(xiàn)出特別強(qiáng)的高溫耐受性[45]。這些熱穩(wěn)定性的噬菌體裂解酶可以應(yīng)用到需要經(jīng)過巴氏消毒等熱處理的一些食品工藝中。裂解酶Ply511和 Ply118可以有效抑制李斯特菌生長，應(yīng)用在生菜和牛奶等食品中[3]。除此之外，一些裂解酶還可以直接應(yīng)用到食物的消毒和除菌，將水果浸泡在表達(dá)歐文氏菌噬菌體裂解酶的溶液中，歐文氏菌的增殖得到了有效的控制[61]。另一種策略是使用可以在發(fā)酵過程中表達(dá)和分泌裂解酶的乳酸菌來控制病原菌[36-37]。到目前為止，許多研究表明可以通過鑒定新的裂解酶進(jìn)行體外控制食源性病原菌（表1）。但是，大多數(shù)研究都集中在牛奶及其奶制品。因此，在其他眾多食品產(chǎn)品中，還需要開展大量噬菌體裂解酶的相關(guān)研究工作。

2.2 裂解酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

文獻(xiàn)[62]成功研制表達(dá)T4噬菌體裂解酶轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯，可以有效保護(hù)植株對革蘭氏陰性歐文氏菌所導(dǎo)致的軟腐病。文獻(xiàn)[63]利用煙草對裂解酶Cpl-1、Pal（裂解肺炎鏈球菌）和 PlyGBS（針對 B 型鏈球菌噬菌體裂解酶）表達(dá)之后，生產(chǎn)能夠治療人和畜禽疾病的裂解酶蛋白。奶牛乳腺炎是由多種病原微生物感染而引起的奶牛乳腺組織及乳頭發(fā)炎的一種疾病，是嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的一種疾病?？股卦谀膛ｐB(yǎng)殖業(yè)的大量使用，使很多細(xì)菌對常用藥物產(chǎn)生耐藥性，甚至產(chǎn)生多重耐藥，抗生素已經(jīng)無能為力，加之抗生素殘留問題給食品安全造成了巨大隱患，人類開始進(jìn)入后抗生素時(shí)代，因此迫切需要新型的抗微生物制劑。在小鼠乳腺炎模型的研究中發(fā)現(xiàn)，乳導(dǎo)管灌注噬菌體裂解酶λSA2和B30可以顯著的減少導(dǎo)致乳腺炎發(fā)生的3種鏈球菌濃度（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌）。同時(shí)，乳腺組織的炎癥也得到了有效的緩解[59]。裂解酶λSA2-LysK-SH3b（嵌合體）與溶葡萄球菌酶聯(lián)合作用能夠有效清除金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中的病原菌，并且兩者具有協(xié)同作用[32]。另外，能夠產(chǎn)生裂解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠[64]和奶牛[65]均能夠?qū)κ箘?dòng)物對引起乳腺炎的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐受性。

3 裂解酶在革蘭氏陰性菌中的研究

由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外面存在著外膜結(jié)構(gòu)，所以對于革蘭氏陰性菌，加入裂解酶之后這層外膜結(jié)構(gòu)阻擋了裂解酶和細(xì)菌肽聚糖層的結(jié)合，因此，裂解酶不能將革蘭氏陰性菌裂解。最近幾年，很多研究都在探討裂解酶如何跨越細(xì)菌外膜，有效裂解陰性菌的新途徑和新方法。主要策略包括:鑒定本身具有跨膜能力的裂解酶；使用外膜滲透劑；構(gòu)建嵌合體裂解酶和混合裂解酶或抗生素；構(gòu)建裂解酶-抗菌肽融合體等。目前采用較多的方法有使用外膜滲透劑 （Outer Membrane Penetrating agent，OMP）、構(gòu)建嵌合裂解酶和混合裂解酶或抗生素等。其中最常用的OMP是EDTA。研究表明:EDTA與裂解酶聯(lián)合使用時(shí)，裂解酶能發(fā)揮良好的裂解效果，如裂解酶OBPgp279[66]和Lysep3[51]。還有研究證實(shí)裂解酶Lys68與檸檬酸或蘋果酸聯(lián)合使用，能夠有效殺死沙門氏菌和其他一些革蘭氏陰性菌，并強(qiáng)于EDTA[52]?？梢耘c裂解酶聯(lián)合使用的OMP還包括一些陽離子多肽，即抗菌肽，例如PGLa和poly-L-arginine可以增強(qiáng)沙門氏菌裂解酶對大腸桿菌的作用[54]。除此之外，通過充分利用抗菌肽的細(xì)胞膜破壞功能與裂解酶的肽聚糖水解功能，設(shè)計(jì)可以穿透細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)到達(dá)肽聚糖層發(fā)揮作用的融合蛋白，為有效防控多重耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌提供了新思路。典型的例子是將裂解酶KZ144的N端融合抗菌肽SMAP-29，通過原核表達(dá)之后N端抗菌肽能夠幫助裂解酶SMAP-29-KZ144和細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層結(jié)合，高校切割形成肽聚糖的化學(xué)鍵，革蘭氏陰性的菌銅綠假單胞菌得到了有效的裂解[67]。另外，OBPgp279是含有9肽的融合裂解酶蛋白，OBPgp279單獨(dú)或和0.5 mmol/L的EDTA聯(lián)合使用能夠在30 min內(nèi)使細(xì)菌濃度降低5個(gè)數(shù)量級[53]。

此外，研究還表明，一些裂解酶具有從外裂解革蘭氏陰性菌的能力。包括沙門氏菌噬菌體SPN9CC裂解酶[55]，解淀粉芽孢桿菌噬菌體裂解酶Lys1521[68]和對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有裂解活性的鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體裂解酶LysAB2[69]。存在這種獨(dú)特溶解特性可能的原因是這些裂解酶固有的一些陽離子或者存在能干擾細(xì)菌外膜的雙親性螺旋基序，提高了細(xì)胞膜的滲透性。還有一些裂解酶對革蘭氏陰性菌發(fā)揮裂解作用的前提條件是細(xì)菌需要經(jīng)過熱或氯仿等滅活處理，像阪崎腸桿菌噬菌體裂解酶LysSs1[70]，高度熱穩(wěn)定性的Thermus scotoductus噬菌體裂解酶Ph2119[71]。總之，裂解酶對革蘭氏陰性菌的自外裂解研究還處于起步階段，還有很多工作值得深入研究。然而，利用蛋白質(zhì)工程和基因工程方法對裂解酶及其嵌合體進(jìn)行研究的成功例子，無疑為未來利用裂解酶控制革蘭氏陰性菌感染提供了一種新的途徑和方法。

4 裂解酶對細(xì)菌生物被膜的作用

細(xì)菌生物被膜主要由細(xì)菌分泌的一些糖類（polysaccharides）組成，包裹在細(xì)菌周圍，不僅保護(hù)細(xì)菌免受宿主免疫細(xì)胞的攻擊，而且使細(xì)菌很難被抗生素或普通消毒劑清除，非常容易造成臨床和食品生產(chǎn)加工的持續(xù)感染和持續(xù)污染[72]。研究表明，噬菌體裂解酶對生物被膜有降解作用，能清除特定的生物被膜。裂解酶LysH5在6 h之內(nèi)就能夠有效清除96孔板中金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌形成的生物膜[13]。金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶PlyGRCS也能對生物膜發(fā)揮作用，有趣的是，PlyGRCS只有一個(gè)酶促活性域，卻表現(xiàn)出N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶和D-alanyl-glycyl肽鏈內(nèi)切酶兩種酶活功能[26]。另外，對8種完全不同的葡萄球菌噬菌體裂解酶降解生物膜的能力進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)它們對生物膜的裂解活力存在差異，活性最高的是LysK[18]。其他裂解酶降解生物膜的能力依次為:SAL-1 （幾乎與 LysK 相當(dāng)）[27]，phi11 （與 LysH5相當(dāng)）[19]，PlySs2（即 CF-301）[49]，SAP-2[73]和 CHAP（K）[22]。 其中，CHAP（K）是金黃色葡萄球菌噬菌體 K裂解酶LysK的截短結(jié)構(gòu)域CHAPK（Cysteine histidine dependant amidohydrolase/peptidase） 產(chǎn)生的肽酶。研究表明CHAP（K）能在4 h內(nèi)完全消除金黃色葡萄球菌DPC5246生物被膜。此外，CHAP（K）還能阻止金黃色葡萄球菌DPC5246形成生物被膜，并能夠減少皮膚表面定殖的金黃色葡萄球菌數(shù)量。除此之外，酰胺酶PlyLM和蛋白酶K聯(lián)合作用可以清除李斯特菌生物膜結(jié)構(gòu)[48]。沙門氏菌裂解酶Lys68可以有效的裂解多種革蘭氏陰性菌形成的生物膜[52]。不難發(fā)現(xiàn)，裂解酶對革蘭氏陽性菌和陰性菌形成的生物被膜都有一定的降解作用，而且有些清除生物被膜的能力比較強(qiáng)，在前人的研究基礎(chǔ)和啟發(fā)下，繼續(xù)發(fā)掘和設(shè)計(jì)針對食源性病原菌生物膜的裂解酶及其嵌合體，對于保障食品安全具有重要的作用和巨大的潛力。

5 展 望

多重耐藥菌株的出現(xiàn)和快速傳播，嚴(yán)重危害食品安全、動(dòng)物和人類健康，在尋找新型抗菌分子或抗生素替代品的研究中，人們發(fā)現(xiàn)噬菌體裂解酶有著抗生素眾多無法比擬的優(yōu)點(diǎn):高效的殺菌活性；本身是一類蛋白質(zhì)，易于人工設(shè)計(jì)和改造；不易產(chǎn)生耐藥性；不同裂解酶之間的協(xié)同效應(yīng)等。這些特點(diǎn)使裂解酶具有用于控制耐藥細(xì)菌污染食品生產(chǎn)加工從而保障食品安全的大潛力。食品生產(chǎn)的流程長、環(huán)節(jié)多，裂解酶可以作為其中的一員或者直接應(yīng)用到某一個(gè)環(huán)節(jié)來中。目前這方面的研究報(bào)道也越來越多，從研究趨勢來看，裂解酶不僅可以在食品生產(chǎn)和加工中發(fā)揮積極、有效的作用，而且可以作為食品添加劑和祛除細(xì)菌生物膜強(qiáng)有效的武器應(yīng)用到食品工業(yè)中。特別是隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對裂解酶的結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行多種改造，使其能夠適應(yīng)各種不同的物理化學(xué)環(huán)境（如適宜的pH、一定的鹽濃度）和耐受一定的溫度環(huán)境，從而能夠適應(yīng)食品生產(chǎn)的某些重要環(huán)節(jié)，保證食品安全。值得一提的是，裂解酶和其他抗菌物質(zhì)聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，以及噬菌體存在數(shù)量（估計(jì)1 031）之多使其成為具有裂解活性結(jié)構(gòu)域用之不竭的儲藏庫。因此，裂解酶的研究和應(yīng)用有著非常廣闊的前景和價(jià)值。