片仔癀對人結(jié)腸癌SW480細胞株的抑制作用研究

孫平良 黃深 歐海玲 韋龍祥 袁代解 耿曙光 劉佳麗 楊坤

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居世界惡性腫瘤發(fā)病率第2位，位居我國惡性腫瘤中第3位，且其發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢［1-2］。抗癌藥物是腫瘤治療的主要方式之一，作為FOLFOX聯(lián)合化療方案藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）在治療結(jié)直腸癌中有著廣泛的應(yīng)用，但也存在嚴重的毒副作用以及耐藥性等問題［3-4］。片仔癀是我國傳統(tǒng)名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃及蛇膽等藥物經(jīng)獨特生產(chǎn)工藝制作而成，具有清熱解毒、散瘀消腫、活血止痛的功效［5］。大量的實驗和臨床研究結(jié)果表明，中藥內(nèi)服在防治腫瘤方面有著獨特優(yōu)勢，其能降低腫瘤放化療引起的毒副作用、減輕患者痛苦、改善患者生活質(zhì)量等。但是，片仔癀等中藥制劑治療胃腸腫瘤的給藥途徑多為灌胃或內(nèi)服，或者是體外實驗而已，直接外用治療腫瘤的研究報道少之又少。因此，能否找到一種增效減毒的中醫(yī)中藥外用方法治療結(jié)直腸癌成為中醫(yī)藥界未來探究的一大方向。本研究通過觀察片仔癀外用對人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)外的抑制效果，從而闡述其外用治療結(jié)直腸癌的價值。

材料與方法

一、人結(jié)腸癌SW480細胞株體外實驗

1. 主要材料：人結(jié)腸癌SW480細胞株購于ATCC細胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibico公司，小牛血清購于Clarkbio公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購于Sigma公司，5-FU購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，片仔癀購自漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司。配制前用刀片刮取漳州片仔癀，用50%的二甲基亞砜溶解配制成50 mg/mL，于 4 ℃保存待用。

2. 細胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌細胞SW480培養(yǎng)于含100 g/L小牛血清、1 kU/L青霉素、1 mg/L鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養(yǎng)箱中，細胞貼壁生長后，每2 d更換培養(yǎng)基，每3 d傳代1次。按5×106細胞加入凍存液1 mL的密度凍存。復(fù)蘇時，從液氮罐中取出細胞，于37 ℃快速解凍，離心去除凍存液，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞接種次日貼壁良好，接種后2～3 d 生長旺盛。

3. 細胞增殖活力檢測（MTT法）：取對數(shù)生長期人結(jié)腸癌SW480細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加0.1 mL。按隨機數(shù)字表法分為片仔癀組（藥物濃度分 1 mg/mL，2 mg/mL，3 mg/mL，4 mg/mL，4 個亞組）、5-FU陽性對照組（濃度為10 μg/mL）和空白對照組，每組復(fù)種6孔。將細胞置于37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，去掉舊培養(yǎng)液。片仔癀組和5-FU陽性組每孔分別加入上述濃度含藥培養(yǎng)液0.2 mL，空白對照組加入無藥新鮮培養(yǎng)液 0.2 mL，繼續(xù)置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，每孔加入 0.5% MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，去掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞颯（DMSO）100 μl，酶標儀上振蕩30 s，于波長570 nm測定光密度（OD）值。抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值×100%。細胞形態(tài)學(xué)觀察：人結(jié)腸癌SW480細胞取用2 mg/mL 的片仔癀干預(yù) 24 h、48 h、72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化并拍照記錄。

二、人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)實驗

1. 實驗動物：SPF級昆明種小鼠150只，雌雄各半，體重（20±2）g，同性別小鼠之間的體重相差不超過3 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號碼：SCXK桂2014-20002。

2. 主要材料：細胞培養(yǎng)材料同人結(jié)腸癌SW480細胞株體外實驗。抗熒光衰減封片劑、平衡鹽溶液（PBS）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）購于bioswamp公司，甲醛購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要儀器有：正置顯微鏡（OLYMPUS公司，型號CX41），移液器（吉爾森P型移液器公司，型號P2、P10、P20、P100、P200、P1000），恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司，型號DHG-9023A），石蠟切片機（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號RM2235），攤片機（湖北康強醫(yī)療器械有限公司，型號TKD-TK），數(shù)碼相機（NIKON公司，型號D5100）。

3. 建模方法：細胞培養(yǎng)同人結(jié)腸癌SW480細胞株體外實驗。將已培養(yǎng)好的SW480結(jié)腸癌細胞去除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶2次，加入體積分數(shù)為0.25的胰蛋白酶數(shù)滴消化，將消化好的細胞吸入離心管內(nèi)，以600轉(zhuǎn)/min的離心機離心6 min，棄上清，加入不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基3 mL，吸管吹打混勻，再離心，棄上清，按每只小鼠皮下接種細胞數(shù)2.5×109/L，再加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，供小鼠背部皮下接種用。準備好的人結(jié)腸癌SW480細胞懸液經(jīng)臺盼藍染色活細胞數(shù)占95%以上，按每只0.2 mL人結(jié)腸癌SW480細胞懸液注射于消毒后的小鼠背部皮下，觀察腫瘤移植成功率。

4. 實驗分組給藥：建模成功待瘤體生長約100 mm3后，將150只昆明小鼠隨機分為模型組，片仔癀低、中、高劑量組和5-FU組，每組30只。片仔癀低、中、高劑量組藥液濃度分別2、4、6 mg/mL，5-FU 組藥液濃度為 0.8 mg/mL。均取5 mL溶液，以紗條浸潤，完全吸收溶液后，外敷瘤處，每次外敷30 min；模型組以相同劑量的生理鹽水外敷。每日2次，連用3 d，每日觀察小鼠一般情況。

5. 抑瘤率：在治療3 d后，以頸椎脫臼法處死各組小鼠，剝離腫瘤組織，稱重，測量腫瘤長、寬及質(zhì)量后，計算抑瘤率。抑瘤率以模型組和給藥組腫瘤體積及瘤體質(zhì)量的變化進行計算，腫瘤體積（TV）的計算公式為TV=a×b2/2，其中a、b分別表示瘤體的長、寬。腫瘤體積抑制率=1-（實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積）×100%，瘤重抑制率=（1-實驗組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

6. 原位凋亡檢測（TUNEL法）：切取每組小鼠瘤體組織塊厚度約為0.2～0.3 cm，大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 制作石蠟切片。（1）對于石蠟切片：①二甲苯中脫蠟5～10 min，換新鮮的二甲苯再脫蠟 5～10 min，無水乙醇 5 min，90% 乙醇 2 min，70% 乙醇 2 min，蒸餾水 2 min；②用蛋白酶 K 工作液于 21℃ ～37℃中孵育 15～30 min；③PBS洗滌3次；（2）準備TUNEL反應(yīng)混合液；（3）加入50 ul TUNEL檢測液于樣品上，在濕盒、暗室中加蓋37 ℃孵育60 min；（4）用PBS沖洗3次；（5）用抗熒光衰減封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。觀察10個高倍鏡視野，以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，計數(shù)1 000個癌細胞中的表達陽性數(shù)作為凋亡指數(shù)（AI）。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對兩組實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，比較采用t檢驗，抑制率組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人結(jié)腸癌SW480細胞株體外實驗結(jié)果

各組對人結(jié)腸癌SW480細胞株體外抑制結(jié)果，經(jīng)皮爾森（Pearson）卡方檢驗得出1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL 組抑制率與 5-FU 組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.49，4.97，4.52；均P＜0.05）；4 mg/mL組抑制率與5-FU組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.57，P＞0.05）；2 mg/mL組抑制率與1 mg/mL、3 mg/mL組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.01，0.01；均P＞0.05）；見表1。熒光顯微鏡顯示空白組與2 mg/mL片仔癀組不同時間段人結(jié)腸癌SW480細胞株數(shù)量比較，后者均顯示不同程度的顯著減少、體積變小、折光性差、細胞懸浮、脫落死亡，見圖1。

二、人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)實驗結(jié)果

各組對人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)抑制結(jié)果經(jīng)皮爾森（Pearson）卡方檢驗顯示，片仔癀高、中、低劑量組對人結(jié)腸癌SW480細胞的體內(nèi)抑瘤率分別為51%、39%、23%，其中高、中劑量組與5-FU組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.05，0.49；均P＞0.05），低劑量組與5-FU組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.09，P＜0.05），高、中劑量組的組間比較顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.87，P＞0.05），具體見表2。熒光顯微鏡顯示片仔癀各劑量組和5-FU組對人結(jié)腸癌SW480細胞均有不同程度的凋亡反應(yīng)。

表1 各組對人結(jié)腸癌SW480細胞株體外抑制率

表2 各組對人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)抑制率

圖1 空白組與2 mg/mL片仔癀細胞凋亡熒光檢測圖。空白組的細胞胞質(zhì)均勻，核仁清晰，細胞壁完整，伸展性良好，生長速度較快；2 mg/mL片仔癀干預(yù)后可發(fā)現(xiàn)的細胞形態(tài)的顯著改變，人結(jié)腸癌SW480細胞數(shù)量逐漸減少，細胞胞質(zhì)渾濁，體積縮小，折光性較差，細胞數(shù)量懸浮、凋亡脫落；1A：空白對照組；1B：2 mg/mL片仔癀干預(yù)24 h對人結(jié)腸癌SW480細胞體外抑制；1C：2 mg/mL片仔癀干預(yù)48 h對人結(jié)腸癌SW480細胞體外抑制；1D：2 mg/mL片仔癀干預(yù)72 h對人結(jié)腸癌SW480細胞體外抑制

圖2 各組體外細胞凋亡熒光檢測圖。較空白組，各治療組干預(yù)后可發(fā)現(xiàn)的細胞形態(tài)的顯著改變，人結(jié)腸癌SW480細胞數(shù)量逐漸減少，折光性較差，細胞數(shù)量懸浮、凋亡脫落。2A：空白對照組；2B：5-FU組對人結(jié)腸癌SW480細胞體內(nèi)抑制；2C：2 mg/mL片仔癀低劑量對人結(jié)腸癌SW480細胞體內(nèi)抑制；2D：4 mg/mL片仔癀中劑量對人結(jié)腸癌SW480細胞體內(nèi)抑制；2E：6 mg/mL片仔癀高劑量對人結(jié)腸癌SW480細胞體內(nèi)抑制

討 論

結(jié)直腸癌屬于中醫(yī)“鎖肛痔”“腸覃”“積聚”“腸癖”等范疇。中醫(yī)認為結(jié)直腸癌發(fā)病的主要病機病因是“濕熱瘀毒”，以清熱解毒，活血化瘀為治療原則?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)、化療、放療等治療為主，但大部分患者發(fā)現(xiàn)時結(jié)直腸癌多屬晚期，常合并有腸穿孔、腸梗阻、癌性疼痛等并發(fā)癥，致手術(shù)難度大，預(yù)后較差。隨著該病發(fā)展，患者的5年生存率大幅下降［6］。中藥內(nèi)服在防治腫瘤方面有著獨特優(yōu)勢，中藥外用亦取得顯著療效，特別是對于那些低位結(jié)直腸癌患者。

片仔癀是我國傳統(tǒng)名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等藥物經(jīng)獨特生產(chǎn)工藝制作而成，具有清熱解毒、散瘀消腫、活血止痛的顯著功效［5］。其中三七散瘀止血、消腫定痛、行滯通脈，牛黃清熱瀉火，蛇膽清熱解毒。其廣泛用于熱毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、癰疽疔瘡、無名腫毒及各種炎癥的治療［7］。

5-FU抑瘤的機制主要是其在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠TMP），從而影響DNA的合成［8］。5-FU對結(jié)直腸癌細胞具有抑制作用，但因其副作用大，臨床上需與其他藥物合用以降低副作用。

本實驗通過對比不同劑量的片仔癀和5-FU對人結(jié)腸癌SW480細胞進行體內(nèi)外干預(yù)，觀察其抑瘤率及凋亡情況。從人結(jié)腸癌SW480細胞株體外實驗得出：片仔癀各組對SW480細胞有著顯著的抑制效果，其中，1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL組的體外抑制作用甚至優(yōu)于5-FU，但不同劑量間的差別卻并不明顯，這可能與實驗設(shè)計劑量階梯差異不足夠明顯有關(guān)，亦或是SW480細胞對片仔癀的劑量變化本身并不敏感。在SW480細胞體內(nèi)實驗中，發(fā)現(xiàn)各組對結(jié)腸癌均有不同程度的抑制作用，其中，片仔癀中、高劑量組（4 mg/mL、6 mg/mL）對人結(jié)腸癌SW480細胞株體內(nèi)抑制作用與5-FU相近，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而低劑量組的抑制率則不如中、高劑量組。這提示臨床應(yīng)用中采用高劑量可能取得更好效果，但這一結(jié)果與體外實驗并不相同，可能與動物模型或體內(nèi)環(huán)境有關(guān)，具體原因仍然需要后續(xù)進行更多動物模型運用及不同劑量的調(diào)試驗證。

根據(jù)圖2的實驗結(jié)果分析，當細胞凋亡發(fā)生時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA；細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn) 180～200 bp 的 DNA ladder；基因組DNA斷裂時，暴露3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上綠色熒光探針熒光素標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡檢測?；谠撛淼贸觯孩僭隗w外實驗中，空白組的細胞胞質(zhì)均勻，核仁清晰，細胞壁完整，伸展性良好，生長速度較快；2 mg/mL片仔癀干預(yù)后可發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)的顯著改變，人結(jié)腸癌SW480細胞數(shù)量逐漸減少，細胞胞質(zhì)渾濁，體積縮小，折光性較差，細胞數(shù)量懸浮、凋亡脫落；②在體內(nèi)實驗中，各治療組熒光顯示均弱于空白組，說明各組對人結(jié)腸癌SW480細胞均有一定程度的抑制作用。

近年來，隨著中醫(yī)中藥治療結(jié)直腸癌的不斷深入研究，其在治療結(jié)直腸癌中取得很好的效果，研究表明白花蛇舌草、敗醬草、莪術(shù)和白首烏等具有抗腫瘤作用［9-12］。片仔癀能明顯改善晚期癌癥患者疼痛、縮小瘤體、延長生命、提高生活質(zhì)量等［13-14］。片仔癀直接干預(yù)結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)基可以抑制結(jié)腸癌株干細胞增殖、調(diào)控ABCC1抑制結(jié)腸癌等［15-16］。片仔癀外敷腫瘤組織能有效緩解中晚期肝癌癥狀，對骨肉瘤及體外結(jié)腸癌細胞增殖具有顯著抑制作用，且其具有多層次、多途徑、多靶點的作用特點，可改善晚期結(jié)直腸癌患者生活質(zhì)量，延緩病情進展等［17-18］。片仔癀外用主要是通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)大腸癌細胞凋亡、抑制大腸癌細胞的增殖、抑制腫瘤血管新生、抑制多條大腸癌相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多方面共同起效的。但是，以上片仔癀治療結(jié)腸癌的研究，給藥途徑均是體外實驗或者使用片仔癀灌胃的方式來進行的，尚未發(fā)現(xiàn)有片仔癀在機體外用直接干預(yù)腫瘤的研究報道。

本次實驗通過不同濃度片仔癀直接干預(yù)人體結(jié)腸癌SW480細胞株在培養(yǎng)基中的增殖及外敷人體結(jié)腸癌小鼠體表瘤組織，經(jīng)治療后表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用，且對片仔癀產(chǎn)生濃度依賴性。在臨床上，中醫(yī)中藥外治如局部外敷、熏洗、燙療及中藥保留灌腸等對腫瘤患者具有一定的療效，譬如中藥保留灌腸治療低位結(jié)直腸癌。隨著科研檢測技術(shù)的不斷發(fā)展及對中藥藥理的不斷認識，中醫(yī)中藥外用有望成為治療結(jié)直腸癌的一種有效治療方法。