雌激素受體α抑制劑MPP在小鼠囊胚形成和滋養(yǎng)層干細(xì)胞中影響YAP核定位

許頌華 ，朱靈華，劉玥 ，王曉江，鐘玉環(huán)，蘇楊，許麗旋，王世鄂

（1干細(xì)胞工程與再生醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350108；2福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福州 350108；3福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級(jí)本科班，福州 350108）

雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）是一種在生殖系統(tǒng)中具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。我們的前期研究表明，ERα在小鼠植入前胚發(fā)育中發(fā)揮作用，其特異性抑制劑甲基-哌啶-吡唑（methyl-piperidino-pyrazole，MPP）可抑制小鼠囊胚形成[1]。成熟的囊胚包括內(nèi)在的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass, ICM）和位于外層的滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE）。囊胚植入母體子宮后，ICM最終發(fā)育為胎兒個(gè)體，在體外分離培養(yǎng)則可形成胚胎干細(xì)胞（ESCs）；TE參與構(gòu)成胎盤，也可分離培養(yǎng)，形成滋養(yǎng)層干細(xì)胞（trophoblast stem cells，TSCs）。前期研究表明，MPP可影響TE關(guān)鍵因子Cdx2的表達(dá)[1]，但其作用機(jī)制尚未明確。在小鼠囊胚形成期間，Hippo信號(hào)通路位于Cdx2上游[2]，且該通路的關(guān)鍵因子YAP在腫瘤細(xì)胞中與ERα密切相關(guān)[3]，但二者在囊胚形成期間的作用，以及對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究分別在小鼠桑葚胚和TSCs細(xì)胞中研究ERα抑制劑MPP對(duì)YAP的表達(dá)的影響。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步揭示ERα在囊胚植入、胎盤形成等方面的作用具有一定的意義。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明（Kunming, KM）小鼠（雌鼠4～6w，雄鼠＞8w）購(gòu)自上海斯萊克公司（SCXK（滬）2012-0002），飼養(yǎng)3～5d，調(diào)節(jié)生理周期（光照周期07∶00-19∶00），使其適應(yīng)環(huán)境[福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK(閩)2016-0006]供實(shí)驗(yàn)處理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均符合福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定（批號(hào)：2018-004）。

2 主要試劑

MPP，Tocris公司；KSOM培養(yǎng)液，Millipore公司；M2培養(yǎng)液，Sigma公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG），寧波激素制藥二廠；人絨毛膜促性腺激素（hCG），Prospec公司；免疫染色固定液，碧云天公司；抗YAP鼠單克隆抗體，Abnova公司；抗E-cadherin兔多克隆抗體，Cell Signaling公司；抗Sox2鼠單克隆抗體，Santa Cruz公司；抗Cdx2鼠單克隆抗體，BioGenex公司；Alexa Fluor? 488標(biāo)記驢抗鼠二抗、Alexa Fluor? 594 標(biāo)記驢抗兔二抗，Life Technology公司；Quick-RNATMMicroPrep R1050試劑盒，Zymo公司；Reverse Transcription Kit試劑盒、dNTP Mix，Thermo公司；SYBR? Premix Ex TaqTM，Roche公司；PCR引物，上海生工；DMEM，Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS，Gibco公司；FGF4，Peprotech公司；無鈣和鎂離子的PBS、胰蛋白酶，Invitrogen公司；肝素，Sigma公司。小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞系獲贈(zèng)于廈門大學(xué)王海濱教授實(shí)驗(yàn)室。

3 主要儀器設(shè)備

水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司；體視顯微鏡、熒光顯微鏡，Nikon公司；激光掃描共聚焦顯微鏡，Leica公司；PCR儀，Gene公司；Real Time-PCR儀，Thermo公司。

4 小鼠超排卵和受精

KM雌性小鼠腹腔注射10IU PMSG，46～48h后注射6IU hCG，隨后與KM雄性小鼠1∶1合籠（♀KM×♂KM），次日清晨檢查陰栓判斷是否受精。

5 小鼠8-細(xì)胞胚的收集和體外培養(yǎng)

于hCG 注射后 64h，將有陰栓的雌鼠以頸椎脫臼法處死，打開腹腔，迅速分離并剪下輸卵管和子宮，于室溫 M2培養(yǎng)液中稍洗滌，用 M2培養(yǎng)液沖出輸卵管中的8-細(xì)胞胚，在室溫M2培養(yǎng)液中洗滌3次，再用37℃、5% CO2平衡好的KSOM液滴洗滌3次，將形態(tài)完好的8-細(xì)胞胚移至預(yù)孵育的培養(yǎng)液滴（分為對(duì)照組0μmol/L MPP和實(shí)驗(yàn)組5μmol/L MPP）中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，觀察并記錄各培養(yǎng)液滴中發(fā)育至桑葚胚及囊胚的情況。

6 小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)與MPP處理

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）制備：從孕鼠子宮中取出13-14d胎鼠，置于無鈣、鎂離子的PBS（CMF-PBS）中，并剪去四肢、頭部、尾巴及內(nèi)臟，再用無鈣、鎂離子的PBS過3遍。洗凈后，0.25%的胰蛋白酶消化3min，并用移液槍反復(fù)吹打，促進(jìn)組織消化。吸取消化液，轉(zhuǎn)移至已添加10mL DMEM/10%FBS的100mm培養(yǎng)皿中，隔天傳代：吸去培養(yǎng)液，并用CMF-PBS沖洗兩次。加入2ml 0.25%胰酶-EDTA 37α消化3min左右并用移液槍溫和吹打，再加入等體積DMEM/10% FBS終止消化。將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，200×g（1400r/min）離心3min。去除上清液，加入1ml DMEM/10% FBS重旋細(xì)胞（輕柔吹打），1∶2傳代。絲裂霉素C（MMC）處理：待培養(yǎng)皿中MEFs匯合90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液并添加含有10μg/ml MMC的DMEM/10% FBS（0.1mL 1mg/ml MMC），37℃孵育2h（不超過3h）。收集細(xì)胞，-80℃凍存，隔天轉(zhuǎn)移到液氮罐。

MEF條件培養(yǎng)基（Mouse embryonic fibrolast conditioned medium，MEF-CM）制備：37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇一管MMC-MEFs細(xì)胞，并加入含有9ml DMEM/10% FBS的15ml離心管中，1400r/min離心3min。去除上清液，用10ml的TS培養(yǎng)液（不含F(xiàn)GF4和肝素）重旋細(xì)胞并接種在100-mm培養(yǎng)皿上。37℃孵育3d不更換培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)液。4℃、2300×g（5000r/min）離心20min。收集上清液，用0.22μm玻璃纖維膜過濾至500 mL玻璃瓶中。以30～40 ml分裝儲(chǔ)存在-20℃。

小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：復(fù)蘇小鼠TSCs細(xì) 胞， 置 于 70CM + 1.5×F4H（37.5ng/ml FGF4+1.5μg/ml 肝素+ 70% MEF-CM）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)大約60%時(shí)，傳代培養(yǎng)。隔2d后更換新鮮 TS+F4H培養(yǎng)液，隨后每隔一天換液培養(yǎng)直至傳代。

小鼠TSCs細(xì)胞MPP處理：將小鼠TSCs細(xì)胞培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)大約60%時(shí)，經(jīng)消化、稀釋，按1∶4種于24孔板，同時(shí)添加MPP過渡液，使液終濃度分別為0、2.5、5、10μmol/L，48h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

7 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)

分別收集各組小鼠桑葚胚（或TSCs細(xì)胞），用0.1% PVA-PBS連續(xù)清洗3次；4%多聚甲醛中室溫固定1h；用0.1% PVA-PBS連續(xù)清洗3次，然后置于0.5% Triton X-100中，室溫通透0.5h；用0.2% BSA連續(xù)清洗3次，然后置于0.2% BSA中，室溫封閉1h；封閉結(jié)束后，置于一抗中4℃孵育過夜；次日，將細(xì)胞用PBST清洗3次，每次10min，然后置于二抗稀釋液中（1∶1000稀釋），室溫避光孵育1h；用PBST分別清洗3次，每次10min，然后置于DAPI（1∶5000稀釋）染液中，室溫避光孵育1h；用PBST分別清洗3次，每次10min。陰性對(duì)照用PBS取代一抗。激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀察。

8 Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)

分別收集各組小鼠桑葚胚（或TSCs細(xì)胞），用DEPC處理過的0.3% PVP-PBS洗滌3次后，每40枚桑葚胚（或六孔板TSCs細(xì)胞）置于裝有400μl RNA Lysis Buffer離心管中。根據(jù)Quick-RNATMMicroPrep R1050試劑盒說明書提供的方法提取總RNA。用NanoDrop ND-1000（NanoDrop, USA）檢測(cè)RNA的濃度和純度。根據(jù)Reverse Transcription Kit試劑盒說明書，使用PCR 儀合成cDNA。PCR引物序列信息列于表1（桑葚胚和TSCs細(xì)胞的Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)分別采用H2afz和GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參）。在Real Time-PCR 擴(kuò)增儀上采用SYBR?PremixEx TaqTM進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件設(shè)置為95°C，10min，1個(gè)循環(huán)，95°C，15s，40 個(gè)循環(huán)，60°C，1min，40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

表1 引物序列Tab.1 Primer sets used in the present study

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

激光共聚焦掃描顯微鏡所得圖片用SmtScape軟件測(cè)定分析熒光強(qiáng)度；采用2-△△ct法處理 Real Time-PCR結(jié)果；利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)方差齊性后運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 YAP在小鼠早、中、末期桑葚胚中的定位分布

小鼠囊胚形成起始于桑葚胚期，因此檢測(cè)YAP在這一階段的動(dòng)態(tài)定位變化，有助于揭示其功能。YAP在早期桑葚胚（hCG后72h）的卵裂球中均有分布，且細(xì)胞核著色深，細(xì)胞質(zhì)著色淺。在中期桑葚胚（hCG后78h）的內(nèi)層細(xì)胞中，細(xì)胞核不著色，細(xì)胞質(zhì)著色淺；外層細(xì)胞中，細(xì)胞核著色深，細(xì)胞質(zhì)著色淺。在后期桑葚胚（hCG后88h）的內(nèi)層細(xì)胞中，細(xì)胞核不著色，細(xì)胞質(zhì)著色變淺；外層細(xì)胞中，細(xì)胞核著色深，細(xì)胞質(zhì)著色變淺（圖1A）。

圖1 YAP在桑葚胚期的階段性定位以及MPP處理對(duì)其表達(dá)的影響。A，早、中、末期（分別對(duì)應(yīng)hCG后72h、78h和88h）桑葚胚中的YAP定位，其中cross-section為掃描的斷面之一，Z-series為多層掃描斷面圖像的疊加；B，5μmol/L MPP不同時(shí)間段處理對(duì)小鼠桑葚胚YAP表達(dá)的影響；C-E，分別為64-72h（C）、64-78h（D）、64-88h（E）5μmol/L MPP處理后的卵裂球細(xì)胞核或質(zhì)中YAP熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜P＜0.05；比例尺，25μmFig. 1 The phase-specific localization of YAP protein in the morula stage and the effect of MPP treatment on its expression. A, localization of YAP in early, middle, and late (corresponding to 72h, 78h, and 88h after hCG, respectively) morulae, where cross-section is one of the scanned sections, and z-series is a superposition of multi-layer scanned section images; B, effect of 5μmol/L MPP treatment in differrent time periods on the expression of YAP in mouse morula; C to E, showing the effects of 5μmol/L MPP treatment on nuclear or cytoplasmic YAP fluorescence intensity after different treatment intervals, namely 64-72h (C), 64-78h (D), 64-88h (E), respectively; *, 0.01＜P＜ 0.05; scale bar, 25μm

2 MPP處理對(duì)小鼠桑葚胚YAP定位和mRNA表達(dá)的影響

我們已經(jīng)證實(shí)5μmol/LMPP處理可抑制小鼠囊胚形成[1]。本研究經(jīng)5μmol/L MPP處理8h后收集早期桑葚胚（hCG后72h），免疫熒光檢測(cè)顯示，YAP在所有卵裂球中都有分布，且與對(duì)照組相比沒有顯著差別（圖1B、1C）；5μmol/L MPP處理12h后收集中期桑葚胚（hCG后76h），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞核或質(zhì)內(nèi)的YAP熒光強(qiáng)度強(qiáng)均無顯著差別（圖1B、1D）；5μmol/L MPP處理24h后收集末期桑葚胚（hCG后88h），實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核熒光強(qiáng)度比對(duì)照組明顯降低，細(xì)胞質(zhì)YAP熒光強(qiáng)度無顯著變化（圖1B、1E）。

小鼠桑葚胚經(jīng)5μmol/L MPP體外培養(yǎng)24h后，與對(duì)照組比較，桑葚胚YAP mRNA表達(dá)水平無顯著改變（圖2）。

圖2 MPP處理24h對(duì)桑葚胚中YAP mRNA表達(dá)的影響。于hCG后64h收集小鼠8-細(xì)胞胚，分別置于0μmol/L MPP與5μmol/L MPP中培養(yǎng)，hCG后88h收集桑葚胚，檢測(cè)YAP mRNA表達(dá)水平變化Fig 2 Effect of MPP treatment for 24 h on YAP mRNA expression in morula. Mouse 8-cell embryos were harvested at 64h after hCG injection, and cultured in 0μmol/L MPP and 5μmol/L MPP, respectively. The morula was harvested at 88h after hCG injection, and the expression level of YAP mRNA was detected

3 MPP處理對(duì)小鼠TSCs細(xì)胞形態(tài)的影響

小鼠TSCs細(xì)胞來源于3.5d囊胚的TE細(xì)胞（圖3A）。2.5μmol/L MPP處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞在形態(tài)上無明顯改變；5μmol/L MPP處理導(dǎo)致TSCs克隆團(tuán)出現(xiàn)疊加在單層細(xì)胞上的細(xì)胞團(tuán)塊；10μmol/L MPP處理組TSCs細(xì)胞克隆團(tuán)明顯減少，呈稀疏團(tuán)塊狀分布（圖3B）。前期研究表明，去除藥物作用后，5μmol/L MPP對(duì)小鼠桑葚胚的抑制作用可被逆轉(zhuǎn)，而10μmol/L MPP的影響不可逆[1]，為了獲得足夠數(shù)量的TSCs細(xì)胞，后續(xù)研究將使用5μmol/L MPP處理作為實(shí)驗(yàn)組。

圖3 MPP處理對(duì)小鼠TSCs細(xì)胞形態(tài)的影響。A，小鼠TSCs細(xì)胞來源以及實(shí)驗(yàn)分組示意圖；B，不同濃度MPP處理48h對(duì)小鼠TSCs形態(tài)的影響；比例尺，50μmFig 3 Effect of MPP treatment on cell morphology of mouse TSCs. A, schematic for source of mouse TSCs and experimental groupings; B, effects of different concentrations of MPP treatment for 48h on the morphology of mouse TSCs; scale bar, 50μm.

4 MPP對(duì)小鼠TSCs中Sox2、YAP和Cdx2 mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)5μmol/L MPP處理48h后，小鼠TSCs細(xì)胞中Sox2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，YAP與Cdx2的mRNA表達(dá)水平無顯著變化（圖4）。

圖4 MPP處理對(duì)小鼠TSCs細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。小鼠TSCs細(xì)胞經(jīng)0或5μmol/L MPP處理48h后檢測(cè)Sox2、YAP和Cdx2 mRNA表達(dá)水平；*，0.01＜P＜0.05Fig 4 Effects of MPP treatment on the expression of mouse TSCs-associated genes. The expression levels of Sox2, YAP and Cdx2 mRNA were detected in mouse TSCs cells treated with 0 or 5 μmol/L MPP for 48h; *,0.01＜P＜0.05

5 MPP處理對(duì)小鼠TSCs中E-cadherin和YAP定位的影響

對(duì)照組E-Cadherin表達(dá)于TSCs細(xì)胞表面，YAP核內(nèi)定位比較明顯。經(jīng)5μmol/L MPP處理后的TSCs細(xì)胞中，已分化細(xì)胞（圖5）的E-cadherin不表達(dá)，YAP仍定位于細(xì)胞核內(nèi)；在實(shí)驗(yàn)組較大的克隆團(tuán)上可見疊加生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊（圖5），此處E-cadherin不表達(dá)，YAP核內(nèi)定位也不明顯（圖5）。

6 MPP處理對(duì)小鼠TSCs中Sox2和Cdx2定位的影響

對(duì)照組Sox2強(qiáng)陽性的細(xì)胞表達(dá)不均勻，主要位于克隆團(tuán)外周的細(xì)胞，內(nèi)部細(xì)胞大多為弱陽性；而5μmol/L MPP實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Sox2強(qiáng)陽性的細(xì)胞則更加均勻和密集地分布于中部和外圍細(xì)胞核內(nèi)（圖6A）。與此相類似，經(jīng)MPP處理后，Cdx2強(qiáng)陽性細(xì)胞的表達(dá)也更加均勻和密集（圖6B）。

討 論

成功的受孕過程至少包括兩方面的要素：形成具有完整功能的囊胚和形成子宮對(duì)囊胚的可接受狀態(tài)，但二者的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確。在小鼠模型中，8-/16-細(xì)胞胚卵裂球表面開始致密化，并在桑葚胚末期吸收水分，使卵裂球內(nèi)部擴(kuò)大為囊腔的過程稱為囊胚形成，標(biāo)志第一次細(xì)胞系分化的完成：形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)外胚層（TE）。在正常生理?xiàng)l件下，TE將侵入子宮內(nèi)膜并最終發(fā)育為胎盤。研究TE的分化以及多能性的維持，對(duì)于深入理解囊胚形成和植入機(jī)制均有重要意義。已有研究表明，Cdx2、Pou5f1、Nanog、Gata3等因子在囊胚形成期間都有重要作用[4]，發(fā)掘更多參與其中的關(guān)鍵因子是國(guó)內(nèi)外研究的一大趨勢(shì)。

圖5 MPP處理48h對(duì)MPP處理對(duì)小鼠TSCs中E-cadherin和YAP蛋白定位的影響。細(xì)箭頭，分化的TSCs細(xì)胞；粗箭頭，細(xì)胞團(tuán)塊；比例尺，50μmFig 5 Effect of MPP treatment for 48h on the localization of E-cadherin and YAP in mouse TSCs. Thin arrows, show the differentiated TSCs; thick arrows, show the cell clumps; scale bar, 50μm

圖6 MPP處理48h對(duì)小鼠TSCs中Sox2和Cdx2蛋白定位的影響。最后一列圖像展示用Nikon熒光顯微鏡相機(jī)自帶的Linescan軟件對(duì)圖中黃色線段區(qū)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的結(jié)果；細(xì)箭頭，克隆團(tuán)外圍細(xì)胞熒光強(qiáng)度；粗箭頭，部分中部細(xì)胞熒光強(qiáng)度；比例尺，50μmFig 6 Effects of MPP treatment for 48 h on Sox2 and Cdx2 protein localization in mouse TSCs. Images of the last panel show the results of fluorescence intensity analysis of the yellow line segment by the Linescan software from the Nikon fluorescence microscope camera; thin arrows, show the fluorescence intensity of the peripheral cells of the clone; thick arrows, show the fluorescence intensity of the middle cells; scale bar, 50μm

Yu等已報(bào)道Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵因子YAP蛋白在GV卵、1-細(xì)胞胚、2-細(xì)胞胚、3/4-細(xì)胞胚、8-細(xì)胞胚、桑葚胚、囊胚中的分布變化，發(fā)現(xiàn)YAP核定位在桑葚胚期僅限于外層細(xì)胞，在囊胚階段定位于TE細(xì)胞[5]。本研究則更加細(xì)化地研究了YAP在桑葚胚前、中、末期的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在中期（約hCG后78h）桑葚胚階段以后才出現(xiàn)內(nèi)層細(xì)胞YAP核定位消失的現(xiàn)象，為進(jìn)一步的藥物處理實(shí)驗(yàn)提供時(shí)間依據(jù)。這些結(jié)果也提示YAP在囊胚形成期間特異性地參與TE的分化。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ERα特異性抑制劑MPP處理24h后YAP核內(nèi)表達(dá)水平降低，但其mRNA表達(dá)水平無顯著變化，提示MPP對(duì)YAP表達(dá)的影響并非通過影響其轉(zhuǎn)錄水平。YAP受到多個(gè)上游因子的調(diào)控，在受級(jí)聯(lián)調(diào)控磷酸化后，磷酸化的YAP與細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3蛋白結(jié)合，抑制YAP的促增殖和抗凋亡活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而沒有被磷酸化的YAP則進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)TEAD4結(jié)合，激活下游因子表達(dá)[2]。MPP對(duì)YAP已知上游因子的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

滋養(yǎng)層干細(xì)胞系（TSCs）來源于TE細(xì)胞，被認(rèn)為是研究胎盤的理想模型，另有研究表明，TSCs繼承了大部分TE關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)標(biāo)記[6]，提示其也可用于分析TE的形成和功能維持機(jī)制。已有研究表明，Eomes、Esrrb、Sox2、Elf5、Cdx2等因子[7-10]對(duì)小鼠TSCs細(xì)胞的干性維持具有重要作用，ERα和Yap在其中的作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MPP處理后，小鼠TSCs細(xì)胞出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)塊。單層貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞若匯合、接觸則出現(xiàn)正常的“接觸抑制”而停止生長(zhǎng)，但若Hippo-YAP信號(hào)受到影響則無法抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，E-cadherin等上皮極性因子的表達(dá)受抑制，出現(xiàn)的疊層的細(xì)胞團(tuán)[11]。這些結(jié)果與本研究觀察到的經(jīng)MPP處理后細(xì)胞團(tuán)塊中YAP核定位不明顯、E-cadherin不表達(dá)的結(jié)果相一致，提示ERα在TSCs中可能通過調(diào)控YAP定位從而發(fā)揮一定的作用。而經(jīng)MPP處理后TSCs細(xì)胞中的Yap mRNA表達(dá)水平也未出現(xiàn)顯著變化，與桑葚胚階段的表現(xiàn)相類似。

為了進(jìn)一步探討ERα的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了經(jīng)MPP處理后Sox2和Cdx2的表達(dá)。結(jié)果表明，MPP處理提高了Sox2 mRNA的表達(dá)水平，但不影響Cdx2 mRNA的表達(dá)水平。Sox2是維持TSCs干性的關(guān)鍵因子[12]，所以MPP可能影響了部分TSCs細(xì)胞的干性。免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組Sox2和Cdx2蛋白強(qiáng)陽性細(xì)胞均主要位于克隆團(tuán)的外圍，而經(jīng)MPP處理后陽性細(xì)胞向克隆團(tuán)中部聚集。提示細(xì)胞干性的變化可能與TSCs細(xì)胞團(tuán)塊的形成，以及YAP、E-cadherin的表達(dá)變化有關(guān)。

上述結(jié)果綜合提示，ERα在小鼠囊胚形成和TSCs細(xì)胞性狀維持中可能具有一定的作用，并影響到Y(jié)AP的定位分布。采用STRING分析可知，在桑葚胚和TSCs細(xì)胞中ERα可能通過不同的信號(hào)通路調(diào)控Yap表達(dá)（圖7），具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖7 ERα與YAP相關(guān)信號(hào)通路STRING分析Fig. 7 STRING analysis of ERα and Yap related signaling pathways