MCM7與RACK1在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

吳非，孫虓，欒嵐，李響，韓昱晨

（1沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽 110024；2 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院病理科，沈陽 110001； 3沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院藥劑科，沈陽 110024；4上海市胸科醫(yī)院病理科，上海 200000）

有活性的蛋白激酶C受體1（receptor for activated C kinase1, RACK1），由GNB2L1基因編碼，分子量為36kDa。RACK1結(jié)構(gòu)中包含7個(gè)WD40重復(fù)序列，相關(guān)報(bào)道提示RACK1的WD40重復(fù)序列正是RACK1與眾多蛋白相互作用的基礎(chǔ)[1]。RACK1主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，為多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供支架，從而涉及多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。RACK1可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、粘附、遷移和免疫[2,3]。微小染色體維持蛋白7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）是微小染色體維持（minichromosome maintenance，MCM）蛋白家族的成員，對(duì)維持MCM復(fù)合體的螺旋酶活性有重要意義，對(duì)于真核細(xì)胞中DNA復(fù)制和增殖的啟動(dòng)至關(guān)重要。本團(tuán)隊(duì)前期研究中，使用酵母雙雜交篩選鑒定MCM7為RACK1結(jié)合蛋白之一。RACK1是MCM7相互作用蛋白。蛋白激酶C激活的特征是由胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞膜或細(xì)胞骨架，這一轉(zhuǎn)位依賴于RACK1蛋白。RACK1缺乏的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。RACK1促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。那么RACK1與MCM7在各類型肺癌組織中如何表達(dá)，是否可以應(yīng)用于臨床病理診斷及指導(dǎo)預(yù)后，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究應(yīng)用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCM7與RACK1在各類型肺癌中表達(dá)，并探討二者與肺癌臨床病理因素間關(guān)系。

材料與方法

1 標(biāo)本

收集中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2008年1月至2016年12月手術(shù)切除的原發(fā)灶及相應(yīng)癌旁正常肺組織石蠟塊，包括肺腺癌150例，肺鱗癌150例，肺大細(xì)胞癌20例和肺小細(xì)胞癌50例。

2 試劑

鼠單克隆抗體 RACK1購自BD公司，鼠單克隆抗體MCM7購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。S-P免疫組化試劑盒（kit-9701）購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)（S-P）法及判讀標(biāo)準(zhǔn)

石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤2h，室溫冷卻后二甲苯脫蠟40min，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5min×3次，后于pH6.0的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)2min，PBS沖洗5min×3次，加入3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶20min，PBS沖洗5min×3次，非免疫動(dòng)物血清室溫孵育10min（以封閉特異性位點(diǎn)），去血清加一抗MCM7（1∶100）、RACK1（1∶200），4℃于冰箱孵育過夜；PBS沖洗5min×3次，加即用型廣譜試劑盒C液（鼠兔共用二抗）室溫孵育20min；PBS沖洗5min×3次，加即用型廣譜試劑盒D液，室溫20min；PBS沖洗5min×3次；DAB顯色，自來水終止顯色。蘇木素復(fù)染，自來水沖洗反藍(lán)，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

以肺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分。MCM7、RACK1陽性表達(dá)根據(jù)陽性細(xì)胞百分率和染色程度進(jìn)行半定量結(jié)果判定：無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞百分率≤50%記1分，51%～75%記2分，≥75%記3分；胞質(zhì)和/或細(xì)胞核基本不著色記0分，染色棕黃記1分，染色棕色記2分，染色褐色記3分。每張切片的陽性細(xì)胞百分率得分和染色程度等分兩項(xiàng)相加作為最后得分?？偡?～1分記陰性（-），2～3分記為弱陽性（+），4～5分記為陽性（++），6分記為強(qiáng)陽性（+++）；以陰性至弱陽性為低表達(dá)，陽性至強(qiáng)陽性為高表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS（Statistical Package for Social Science）13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析、生存分析采用Kaplan-Meier法等。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MCM7與RACK1在肺癌中表達(dá)高于癌旁正常肺組織

MCM7與RACK1在正常支氣管上皮中呈陰性或低表達(dá)，在肺癌中彌漫弱陽性或散在陽性表達(dá)；MCM7陽性定位于細(xì)胞核，RACK1陽性定位于細(xì)胞質(zhì)、膜（圖1）。MCM7與RACK1在肺癌中陽性率為89.5%（287/370）、88.9%（239/370），均明顯高于正常肺組織（MCM：χ2=12.608，P=0.000；RACK1：χ2=25.273，P=0.000）（圖1-圖3，表1）。

2 CM7與RACK1二者在肺癌中表達(dá)與臨床病理因素間關(guān)系

免疫組織化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，MCM7與RACK1的表達(dá)水平均與肺癌的病理分級(jí)（P=0.003，P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.008，P=0.002）、組織學(xué)分類（P=0.000，P=0.000）和TNM分期（P=0.004，P=0.012）相關(guān)。二者與患者年齡（P=0.617，P=0.355）、性別（P=0.110，P=0.613）無相關(guān)性。MCM7高表達(dá)情況在鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC，122/150，81.3%）、腺癌（Adenocarcinoma，ADC，93/150，62.0%）、大細(xì)胞癌（Large cell lung cancer，LCLC，6/20，30%）、小細(xì)胞癌（Small cell lung cancer，SCLC，23/50，46%）；在鱗癌、腺癌中表達(dá)明顯高于其他組織學(xué)類型；RACK1高表達(dá)情況在SCC（123/150，82.0%）、ADC（130/150，86.7%）、LCLC（8/20，35%）、SCLC（5/50，10%）；在鱗癌、腺癌中表達(dá)均明顯明顯高于其他組織學(xué)類型（表2）。

圖1 正常支氣管上皮、鱗狀上皮不典型增生和鱗癌中MCM7和RACK1表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，MCM7在正常支氣管上皮呈陰性；B，RACK1在正常支氣管上皮低表達(dá)(*)，在鱗狀上皮不典型增生(**)和鱗癌(***)中的表達(dá)增強(qiáng)；比例尺，100μmFig. 1 Immunohistochemical exmination for expression of MCM7 and RACK1A in normal bronchial epithelium, squamous epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma. A, MCM7 is negative in normal bronchial epithelial; B, RACK1 is weak in normal epithelium (*) and strong in squamous epithelial dysplasia (**) and squamous cell carcinoma (***); scale bar, 100μm

圖2 MCM7表達(dá)于癌細(xì)胞核。A，鱗癌；B，腺癌；C，大細(xì)胞癌；D，小細(xì)胞癌；比例尺，100μmFig. 2 MCM7 expression in the cancer cell nuclei; A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; C, large cell carcinoma; D, small cell carcinoma;scale bar, 100μm

3 MCM7與RACK1高表達(dá)患者生存時(shí)間縮短

應(yīng)用Kaplan-Meier法分析MCM7、RACK1蛋白表達(dá)與各類型肺癌患者生存時(shí)間（P=0.006，P=0.002，Log-rank檢驗(yàn)）的關(guān)系（圖4，圖5），顯示MCM7、RACK1高表達(dá)組（4-6分）生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組（0-3分）。

4 MCM7與RACK1在肺癌中的表達(dá)正相關(guān)

對(duì)肺癌免疫組化MCM7與RACK1蛋白表達(dá)應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者具有正相關(guān)性（r=0.401，P=0.000）(表 3）。

圖3 RACK1 表達(dá)于癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。A，鱗癌；B，腺癌；C，大細(xì)胞癌；D，小細(xì)胞癌；比例尺，100μmFig. 3 RACK1 expression in cytoplasm and cell membrane of cancer cells. A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; C, large cell carcinoma;D, small cell carcinoma; scale bar, 100μm

表1 MCM7和RACK1在肺癌和癌旁正常肺組織中的表達(dá)Tab. 1 Expression of MCM7 and RACK1 in lung cancer and adjacent normal lung tissues

討 論

MCM7為DNA復(fù)制許可復(fù)合體MCM的關(guān)鍵成員，在控制DNA復(fù)制的起始過程中起重要的作用，與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖密切相關(guān)[5]，其在DNA復(fù)制調(diào)控中的重要作用已愈來愈引起人們的關(guān)注。已有的研究顯示，在多種腫瘤中MCM7表達(dá)升高，MCM7過度表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。腦膜瘤中Ⅱ級(jí)MCM7蛋白表達(dá)水平高于Ⅰ級(jí)[6]。Guan等[7]發(fā)現(xiàn)乳頭狀尿路上皮腫瘤中MCM7表達(dá)隨著腫瘤分級(jí)的增加而升高。然而，Ishibashi等[8]研究表明MCM7是Dukes C期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。體外研究表明，MCM7低表達(dá)顯著抑制食管癌細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖，集落形成和遷移[9]。Kwok等[10]提示MCM2-7基因可能與乳腺癌中的常見轉(zhuǎn)錄因子（AML-1a，GATA-1，SRY）密切相關(guān)。Yang等[11]應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究表明MCM7聯(lián)合Ki67可作為評(píng)價(jià)胃癌和癌前病變的更敏感的增殖指標(biāo)。

有報(bào)道顯示，MCM7在直徑小于3cm的肺腺癌中表達(dá)，與性別、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)亞型、腫瘤大小顯著相關(guān)[12]。也有研究的免疫組織化學(xué)分析顯示，331名非小細(xì)胞肺癌中有196名MCM7陽性染色，而在各種正常組織中未觀察到顯著的染色，研究還發(fā)現(xiàn)MCM7表達(dá)升高與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)[13]。 而本研究的結(jié)果表明MCM7在正常支氣管上皮不表達(dá)，在各種組織學(xué)類型肺癌組織中均有表達(dá)，MCM7高表達(dá)率在各類型肺癌中分別為SCC（122/150，81.3%）、ADC（93/150，62.0%）、LCLC（6/20，30%）、SCLC（23/50，46%），在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)率明顯高于其他組織學(xué)類型。同時(shí)分析出MCM7過度表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致患者生存時(shí)間縮短。還表明MCM7表達(dá)與病理分級(jí)、TNM分期相關(guān)。

表2 MCM7與RACK1在各類型肺癌中表達(dá)與臨床病理因素間關(guān)系Tab. 2 Relationship between expression of MCM7 and RACK1 in various types of lung cancer and clinicopathological factors

圖4 Kaplan-Meier法分析MCM7表達(dá)與各類型肺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系（P=0.006，Log-rank檢驗(yàn)）Fig. 4 Kaplan-Meier analysis of the relationship between MCM7 expression and survival time of various types of lung cancer patients (P=0.006,Log-rank test)

圖5 Kaplan-Meier法分析RACK1與各類型肺癌患者生存時(shí)間（P=0.002，Log-rank檢驗(yàn)）Fig. 5 Kaplan-Meier analysis of the relationship between RACK1 expression and survival time of patients with various types of lung cancer(P=0.002, Log-rank test)

表3 肺癌組織中MCM7與RACK1蛋白表達(dá)的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析)Tab.3 Correlation between MCM7 and RACK1 protein expression in lung cancer tissue microarrays (Pearson correlation analysis)

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)RACK1在許多腫瘤如鼻咽癌、結(jié)腸直腸癌、肺腺癌，肝細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。關(guān)于其在腫瘤發(fā)生中的作用，RACK1主要參與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-18]。然而，其致癌性質(zhì)存在一些相互矛盾的結(jié)果；該蛋白可以對(duì)Src活性產(chǎn)生陰性對(duì)照，并對(duì)Ki-Ras介導(dǎo)的形態(tài)學(xué)細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制作用[19]。據(jù)報(bào)道，它在胃癌中是下調(diào)的，作為負(fù)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)的腫瘤抑制劑[20]。有研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究了184例肺癌和配對(duì)的正常肺組織，RACK1表達(dá)在腺癌中顯著增高且頻繁，但在肺鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌中幾乎檢測(cè)不到。此外，RACK1的表達(dá)也與腺癌患者的病理分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)狀態(tài)顯著相關(guān)[21]。而本研究結(jié)果顯示RACK1在各種組織學(xué)類型肺癌中均有表達(dá)，RACK1高表達(dá)率在各類型肺癌中分別為SCC（123/150，82.0%）、ADC（130/150，86.7%）、LCLC（8/20，35%）、SCLC（5/50，10%）；在鱗癌、腺癌中高表達(dá)率均明顯高于其他組織類型。RACK1表達(dá)水平與肺癌的病理分級(jí)、組織分類、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在III期、IV期肺癌組織中的表達(dá)高于I期、II期肺癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。高表達(dá)者生存時(shí)間短。

我們的前期研究[4]發(fā)現(xiàn) RACK1是MCM7 結(jié)合蛋白之一，并證明RACK1通過MCM7/RACK1 /Akt信號(hào)復(fù)合物介導(dǎo)MCM7磷酸化，從而調(diào)控人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程。 RACK1作為中央腳手架，將Akt與MCM7接近。RACK1的過度表達(dá)增加Akt和MCM7之間的相互作用并促進(jìn)Akt依賴性MCM7磷酸化，這進(jìn)而增加MCM7與染色質(zhì)和MCM復(fù)合物形成的結(jié)合。這些變化一起促進(jìn)DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。研究結(jié)果揭示了調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的新信號(hào)通路[22]。而本研究結(jié)果顯示，MCM7與RACK1不僅在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，在某些小細(xì)胞肺癌中也存在高表達(dá)現(xiàn)象。 那么，二者在小細(xì)胞肺癌中是否也存在調(diào)控關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了RACK1與MCM7在非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌中均存在高表達(dá)現(xiàn)象，且二者表達(dá)具有正相關(guān)性，MCM7與RACK1聯(lián)合檢測(cè)有可能成為各類型肺癌細(xì)胞增殖、預(yù)測(cè)肺癌預(yù)后和臨床靶向治療的生物學(xué)新指標(biāo)。