胸苷磷酸化酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在大腸癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及意義

任建林，祝明潔，陳峰，姚曉虹

（1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院病理科，上海202150；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院病理科，上海 200092）

大腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，大腸癌日趨增多的發(fā)病率及居高不降的病死率，使大腸癌的預(yù)后影響因素一直成為研究的熱點(diǎn)。氟尿嘧啶類(lèi)藥物是大腸癌化學(xué)治療的基礎(chǔ)用藥，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)廣泛應(yīng)用于大腸癌的化療。胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是嘧啶核苷代謝中的關(guān)鍵酶, 作為5-FU的靶酶，它與腫瘤化療效果、腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系。TP與血小板源性?xún)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在結(jié)構(gòu)上一致，功能具有促進(jìn)血管生成作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管的形成，與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前對(duì)大腸癌原發(fā)灶的TP、 VEGF表達(dá)已經(jīng)作了大量的研究，而缺乏對(duì)相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達(dá)的探討。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，聯(lián)合檢測(cè)、分析大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TP和VEGF的表達(dá)，為個(gè)體化化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 病例

收集2010年1月至2012年3月間上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院診治的有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸腺癌患者，入組標(biāo)準(zhǔn)：根治性手術(shù)切除實(shí)體腫瘤；術(shù)后病理為腺癌；有5年以上隨訪(fǎng)資料(生存期) ；術(shù)前未經(jīng)放療及化療，術(shù)后化療方案以5-FU為主，化療前進(jìn)行全面檢查以評(píng)估化療耐受性。凡年齡＞ 80歲；有嚴(yán)重的心肺腦伴發(fā)病，嚴(yán)重的肝腎功能損害的病例不能入組。共入組33例。每例大腸癌原發(fā)灶、相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、切緣正常組織標(biāo)本均經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色（圖1）?；颊吣行?9例，女性14例，年齡45～80歲，平均年齡58±10歲，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）結(jié)直腸癌組織分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)：低分化腺癌25例，中、高分化腺癌8例。

圖1大腸癌原發(fā)灶（A）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（B）HE染色觀察。比例尺，25μmFig. 1 HE staining examination of primary colorectal cancer (A) and the metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

2 主要試劑

鼠抗人VEGF單克隆抗體（即用型）購(gòu)自上海長(zhǎng)島抗體診斷試劑有限公司；鼠抗人TP單克隆抗體（即用型）購(gòu)自北京中衫金橋公司；DAB顯色試劑盒、PV6000通用型二步法免疫組化試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS緩沖液均購(gòu)自上海長(zhǎng)島抗體診斷試劑有限公司。

3 免疫組織化學(xué)染色

運(yùn)用PV6000通用型二步免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)VEGF、TP，采用已知VEGF、TP陽(yáng)性的大腸癌切片作為每批切片的陽(yáng)性對(duì)照，采用PBS緩沖液代替一抗作為每批切片的陰性對(duì)照，染色步驟按PV6000通用型二步法免疫組織化學(xué)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4 結(jié)果判讀

選取隨機(jī)的中倍視野（10×10）4個(gè)，以400個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)計(jì)算，以著色深度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行判定。VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色團(tuán)塊狀或細(xì)顆粒狀，彌漫分布；TP表達(dá)呈顆粒狀棕黃色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均可見(jiàn)表達(dá)。結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比＜10%記 0分，10%～25%記l分，26%～50%記2分，＞50%記3分；無(wú)顯色記0分，淺黃色記1分，中等強(qiáng)度黃色記2分，棕或深黃色記3分；按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比及顯色情況所得分相乘的分值判定各指標(biāo)表達(dá)情況：0分判定為陰性(-)，1-4分判定為低表達(dá)(+)，＞4分判定為高表達(dá)(++)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用 SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，VEGF、TP在大腸癌原發(fā)灶與相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間表達(dá)的差異比較用卡方檢驗(yàn)，VEGF與TP的相關(guān)性用Person相關(guān)分析，P＜0.05差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大腸癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)差異

VEGF在少數(shù)正常大腸黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)弱表達(dá)，在大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞胞質(zhì)中等強(qiáng)度表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)弱至中等強(qiáng)度表達(dá)（圖2）；大腸癌原發(fā)灶中癌細(xì)胞VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率為 21.2% ( 7/33)，相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞VEGF 的陽(yáng)性表達(dá)率為 24.2%（8/ 33）。癌原發(fā)灶中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率與 VEGF在相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）(表1)。

表1大腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中VEGF表達(dá)比較Tab. 1 Comparison of expression of VEGF in primary colorectal cancer and metastatic lymphotic node

圖2 VEGF在大腸癌原發(fā)灶（A）和轉(zhuǎn)移灶（B）表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。比例尺，25μmFig. 2 Immunohistochemical examination of VEGF expression in primary colorectal cancer (A) and metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

2 大腸癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TP陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)差異

TP在少數(shù)正常大腸黏膜上皮呈弱表達(dá)，在大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞中，尤其是浸潤(rùn)前沿的癌細(xì)胞，其表達(dá)強(qiáng)度高于癌巢中間；同時(shí)見(jiàn)間質(zhì)的基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞也有TP表達(dá)（圖3）。TP在原發(fā)灶癌細(xì)胞的低表達(dá)陽(yáng)性率和高表達(dá)陽(yáng)性率分別為6.1%（2/33）和93.9%（31/33），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞的低表達(dá)陽(yáng)性率和高表達(dá)陽(yáng)性率分別為3.0%（1/33）和97.0%（32/33）。原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞的TP高表達(dá)陽(yáng)性率均超過(guò)90%，二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 大腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶TP表達(dá)強(qiáng)度比較Tab. 2 Comparison for expression level of TP in primary colorectal cancer and metastatic lymphotic node

3 TP在大腸癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的陽(yáng)性表達(dá)率均高于VEGF

TP在大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于VEGF，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）(表3、表4) 。TP與VEGF的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（Person相關(guān)系數(shù)r=-0.041，P＞0.05）。

表3 大腸癌原發(fā)灶中VEGF和TP表達(dá)水平比較Tab. 3 Comparison of expression levels of VEGF and TP in primary colorectal cancer

表4 大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中VEGF和TP表達(dá)水平比較Tab. 4 Comparison of expression levels of VEGF and TP in metastatic lymphotic node

圖3 TP在大腸癌原發(fā)灶（A）和轉(zhuǎn)移灶（B）表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。比例尺，25μmFig. 3 Immunohistochemical examination of TP expression in primary colorectal cancer (A) and metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

4 原發(fā)灶間質(zhì)細(xì)胞TP高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞VEGF不表達(dá)的患者生存率更高

隨訪(fǎng)顯示，33例病例中其中7例的平均生存期為71個(gè)月，5年生存率為53%，明顯高于其余26例（平均生存期為38個(gè)月，5年生存率為20%）。在7例預(yù)后較好的病例中，原發(fā)灶炎癥反應(yīng)明顯，間質(zhì)細(xì)胞TP表達(dá)明顯（圖4A），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞VEGF不表達(dá)（圖4B）（表5）。

圖4 預(yù)后較好病例原發(fā)灶TP表達(dá)和轉(zhuǎn)移灶VEGF表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。比例尺，25μmFig. 4 Immunohistochemical examination of TP expression in the primary tumor (A) and VEGF in metastatic lymphotic node (B) of the cases with better prognosis. Scale bar, 25μm

表5 VEGF和TP表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab. 5 Statistical analysis for the relationship of VEGF and TP expression with prognosis

討 論

大腸癌患者確診時(shí)約35%為中晚期,即使是早期發(fā)現(xiàn)的患者也有約一半會(huì)發(fā)生術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)[1]。術(shù)后化療是治療大腸癌的重要手段，氟尿嘧啶類(lèi)藥物，包括5-FU、氟鐵龍、卡培他濱等是大腸癌化療的主要藥物[2]。患者對(duì)5-FU的敏感性存在個(gè)體差異，如何預(yù)測(cè)化療方案的療效是大腸癌個(gè)體化治療需解決的問(wèn)題。

TP能催化5-FU與1-磷酸2-脫氧核糖反應(yīng)，其終產(chǎn)物能夠抑制DNA合成，有抗癌活性，與腫瘤的化療關(guān)系密切。TP同時(shí)又是5-FU前體藥物（氟鐵龍和卡培他濱）轉(zhuǎn)化為5-FU的一個(gè)關(guān)鍵限速酶。盧振霞等[3]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了58例大腸癌患者的正常黏膜和癌組織中TP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中TP的表達(dá)明顯高于正常黏膜；TP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率較高。Haraguchi等[4]研究TP與大腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：有轉(zhuǎn)移的大腸癌患者血清中的TP水平明顯增高，腫瘤組織內(nèi)TP表達(dá)情況與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)大腸癌原發(fā)灶癌細(xì)胞的TP低表達(dá)和高表達(dá)陽(yáng)性率分別為9.1%和90.9%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞的TP低表達(dá)和高表達(dá)陽(yáng)性率分別為3.0%和97.0%。這些結(jié)果提示：大腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的癌細(xì)胞TP表達(dá)水平不存在明顯差異，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌細(xì)胞的TP表達(dá)水平不能預(yù)測(cè)癌細(xì)胞對(duì)以5-FU為基礎(chǔ)的化療的反應(yīng)。但是，Inokuchi等[5]通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)大腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移病灶中TP的mRNA水平發(fā)現(xiàn)：在原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移病灶中TP的mRNA水平有明顯差異。這些結(jié)果的不同可能與患者的數(shù)量、檢測(cè)TP的方法有關(guān)，也可能與TP蛋白的不同亞型在腫瘤化療中發(fā)揮的作用不同有關(guān)。

目前，關(guān)于TP的研究主要集中在癌細(xì)胞，關(guān)于大腸癌及相應(yīng)轉(zhuǎn)移組織中TP表達(dá)的部位報(bào)道不一致。張繼民等[6]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)40例結(jié)直腸癌標(biāo)本研究中發(fā)現(xiàn)，TP在大多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞、特別是巨噬細(xì)胞表達(dá)。Kobayshid等[7]應(yīng)用電子顯微鏡觀察TP在直腸癌中的分布，發(fā)現(xiàn)TP大多分布于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。游偉等[8]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)28例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)TP。Nozawa、 Yasuno等[9-10]的研究表明：腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的TP主要參與血管生成, 基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的TP主要參與局部免疫反應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)：TP在大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)在基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及炎癥細(xì)胞也有表達(dá)；7例預(yù)后較好的病例中，我們觀察到原發(fā)灶炎癥反應(yīng)明顯，炎癥細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞TP表達(dá)明顯。由以上結(jié)果我們推測(cè)：大腸癌癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的TP具有結(jié)構(gòu)和功能上的差異。癌細(xì)胞表達(dá)的 TP可能主要刺激腫瘤的血管新生，與腫瘤的侵襲性相關(guān)；間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 TP可能參與局部免疫反應(yīng)，改善患者的預(yù)后，癌組織中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞表達(dá)TP也會(huì)影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞TP的表達(dá)水平可能預(yù)測(cè)以5-FU為基礎(chǔ)的化療的反應(yīng)，但由于TP在正常黏膜間質(zhì)內(nèi)也有表達(dá),因此尚需大樣本進(jìn)一步研究其意義。

VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖[11-13]。TP刺激內(nèi)皮細(xì)胞趨化和生長(zhǎng)，促進(jìn)血管生成，缺氧可誘導(dǎo)TP的表達(dá)[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)TP主要表達(dá)于浸潤(rùn)邊緣的癌細(xì)胞，推測(cè)與此區(qū)域缺氧有關(guān)系，周?chē)?rùn)的單個(gè)細(xì)胞TP表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度強(qiáng)于癌巢中間。Akiyama S等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)：TP通過(guò)催化胸苷，得到了次級(jí)產(chǎn)物 2-脫氧D核糖，局部組織產(chǎn)生大量的氧自由基，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)后誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，最終TP和VEGF促進(jìn)血管生成。近年來(lái)王書(shū)奎等[17]研究發(fā)現(xiàn)：消化道惡性腫瘤患者血清中的VEGF及TP水平顯著高于消化道良性疾病患者及健康對(duì)照組。Liekens S等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在血管豐富的腫瘤(乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等)有TP和VEGF的共同表達(dá)。臨床上TP抑制劑增強(qiáng)以VEGF通路為靶點(diǎn)的藥物治療效果，提示TP和VEGF共同來(lái)刺激血管生成[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)：大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中的VEGF及TP表達(dá)水平均顯著高于正常大腸黏膜上皮；TP和VEGF在大腸癌共同表達(dá)，共同來(lái)刺激血管生成，與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。雖然目前VEGF的抑制劑已成為抗腫瘤藥物[20]，但我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VEGF在大腸癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 21.2%和 24.2%， TP在大腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于VEGF。我們推測(cè)TP在大腸癌組織中的血管生成作用大于VEGF，TP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中主要發(fā)揮血管生成作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲性。我們發(fā)現(xiàn)在7例預(yù)后較好的病例中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞不表達(dá)VEGF，VEGF不表達(dá)是否能預(yù)測(cè)化療的反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

總之，大腸癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間的TP、VEGF表達(dá)水平不存在顯著差異，TP在腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)有不同的作用。對(duì)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的TP表達(dá)水平可預(yù)測(cè)癌細(xì)胞對(duì)以5-FU為基礎(chǔ)的化療的反應(yīng)，而癌細(xì)胞TP表達(dá)水平不具備預(yù)測(cè)意義。TP介導(dǎo)的血管生成可能是結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要因素。