肺隱球菌病標(biāo)本在六胺銀染色中的最佳溫育時(shí)間

林倩，方慶全

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

隱球菌是廣泛存在于自然界中的一種真菌[1]，肺隱球菌病是由新型隱球菌感染引起的慢性或亞急性肺部疾病[2]，該病由Sheppe于1924年首先報(bào)道[3]，由于臨床癥狀缺乏特異性[4-6]，常被誤診為肺部炎癥、結(jié)核、腫瘤等其他肺部疾病。肺活檢組織病理學(xué)檢查是確診侵襲性肺部真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)[6,7]，理想的六胺銀染色可將基底膜、真菌等陽(yáng)性物質(zhì)染成黑色[8,9]，有助于肺隱球菌病的病理診斷，但傳統(tǒng)的六胺銀染液步驟中采用水溫箱60℃溫育40～60min，作者實(shí)踐發(fā)現(xiàn)該溫育條件存在過(guò)染現(xiàn)象。為了尋求一種染色效果好、操作簡(jiǎn)便、染色時(shí)間短、污染少、染色方法可重復(fù)性高的六胺銀染色方法，我們對(duì)最佳孵育時(shí)間進(jìn)行了摸索。

資料與方法

1 標(biāo)本

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2017年1月—2017年12月確診的30例肺隱球菌感染病例，每例病例選取最具代表意義的一個(gè)蠟塊連續(xù)切片3張，厚度為4μm，不同蠟塊為區(qū)組因素，將每個(gè)蠟塊切取的3張切片簡(jiǎn)單隨機(jī)化分為3組，每組1張，通過(guò)區(qū)組隨機(jī)化將90張切片隨機(jī)分為A、B、C 3組，烤片，常規(guī)脫蠟至水。

2 儀器

LEICA 2245切片機(jī)（德國(guó)萊卡），TY-7FB型生物組織攤烤片機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），H.SWX-600BS電熱恒溫水溫箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

3 試劑

1%高碘酸溶液； 5%鉻酸水溶液； 2.5%草酸溶液；六胺銀溶液配制：3%六次甲基四胺水溶液18ml，加入5%硝酸銀水溶液2ml，再加入5%四硼酸鈉溶液2ml，震蕩至乳白色懸濁液變?yōu)榍辶镣该?，加?2ml蒸餾水，混勻后放入已設(shè)置好的60℃水溫箱溫育5min；0.5%氯化金溶液； 2%硫代硫酸鈉溶液；Harri蘇木素染液；無(wú)水乙醇；二甲苯；中性樹膠。

4 六胺銀染色步驟

①1%高碘酸溶液10min，蒸餾水洗1次；

②5%鉻酸水溶液40min，蒸餾水洗2次；

③2.5%草酸溶液1min，蒸餾水洗1次；

④放入在60℃水溫箱溫育的六胺銀溶液中溫育。其中，A組在六胺銀染液中溫育20～25min，B組在六胺銀染液中溫育30～35min，C組在六胺銀染液中溫育 40～45min。

⑤0.5%氯化金溶液30s，蒸餾水洗2次；

⑥2%硫代硫酸鈉溶液5min，蒸餾水洗1次；

⑦Harri蘇木素襯染5min；

⑧無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

5 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

切片由2名副主任醫(yī)師進(jìn)行雙盲診斷，診斷為肺隱球菌病者為診斷準(zhǔn)確。并對(duì)90張切片進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分采用十分制。10為滿分，10分標(biāo)準(zhǔn)為：染色背景清晰，隱球菌呈現(xiàn)黑色，可以觀察到隱球菌莢膜為空心透明，細(xì)胞核呈藍(lán)色，周圍肺纖維組織呈淡棕色至棕色；5項(xiàng)指標(biāo)若有不同程度的缺陷，各逐減0.1-2分；每張切片得分0分為最低分。每組切片評(píng)分結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組切片的診斷準(zhǔn)確率用百分率表示。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組切片六胺銀染色評(píng)分結(jié)果

A組六胺銀染色得分（7.92±0.18分）顯著低于B組（9.45±0.08分），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.544，P＜0.01）；C組六胺銀染色得分（8.30±0.17分）顯著低于B組（9.45±0.08分），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.031 ，P＜0.01）。

2 三組切片六胺銀染色效果

A組：隱球菌呈棕褐色至淺黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，周圍肺纖維組織呈淡藍(lán)色至棕色，隱球菌與周圍肺纖維組織染色對(duì)比不清晰（圖1A）。B組：隱球菌染成空心黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，周圍肺纖維組織呈淡棕色至棕色，隱球菌與周圍肺纖維組織染色對(duì)比清晰（圖1B）。C組：隱球菌呈團(tuán)塊狀深黑色，少見黑色空心部分，細(xì)胞核與周圍肺纖維組織呈棕褐色至黑色，隱球菌與周圍肺纖維組織不易分辨（圖1C）。B組染色效果高于A組與C組（圖1）。

3 三組切片診斷準(zhǔn)確率

A組切片診斷準(zhǔn)確率為63.3%（19/30），顯著低于B組（100%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.47，P＜0.01）；C組診斷準(zhǔn)確率為83.3%（25/30），低于B組（100%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.45，P＜0.05）。

圖1 六胺銀染色溫育時(shí)間比較。A，60℃孵育20～25min（A組）；B，60℃孵育30～35min（B組）；C，60℃孵育40～45min（C組）；比例尺，100μmFig. 1 Comparison for incubation time of periodic acid-silver metheramine staining. A, 20 to 25min at 60℃(Group A); B, 30 to 35min at 60℃ (Group B); C, 40 to 45min at 60℃ (Group C); scale bar, 100μm

討 論

真菌又稱霉菌，其種類較多，常見的致病菌有：毛霉菌、曲霉菌、新型隱球菌、放線菌和白色念珠菌。近年來(lái)，由于廣譜抗生素、激素、化療和免疫抑制劑的廣泛使用，使人體的抵抗力下降，肺隱球菌病發(fā)病率有上升趨勢(shì)[5-10]。且肺隱球菌病易被誤診為肺腫瘤[11]，因此肺活檢組織病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性顯得尤為重要，這就更需要背景清晰、顯色適當(dāng)、對(duì)比度好的六胺銀染色。

諸多的學(xué)者介紹傳統(tǒng)的六胺銀染色技術(shù)時(shí)，主張六胺銀液60℃溫育1～2h[12,13]。而有些學(xué)者采用各種辦法來(lái)縮短六胺銀液作用時(shí)間，如：翁秀琴等[14]將切片置于保濕盒內(nèi)，滴上六胺銀液后，置保濕盒于68℃烤箱里，在8min時(shí)切片直接置低倍鏡下觀察菌變化，當(dāng)組織液呈現(xiàn)黃褐色，光學(xué)顯微鏡下見隱球菌時(shí)，用蒸餾水沖洗切片終止反應(yīng)。馮家成等[15]采用光波變頻微波輻射技術(shù)將六胺銀液加熱至65℃，將六胺銀液作用時(shí)間縮短至10min左右。但賈云香等[16]研究發(fā)現(xiàn)，六氨銀溶液水浴溫度最好控制在58℃，稍高容易導(dǎo)致切片上過(guò)多雜質(zhì)沉淀，背景不清晰。作者的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，切片在六胺銀液60℃溫育時(shí)，如果作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也易造成過(guò)染，隱球菌與周圍肺纖維組織不易分辨，背景不清晰。

六胺銀染色是真菌染色的重要方法之一，傳統(tǒng)方法中，在溫育時(shí)間上給予的染色時(shí)間較為寬泛，一般為40～60min，甚至1～2h，且還需時(shí)時(shí)在顯微鏡下觀察，操作繁瑣，工作效率低下。作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A組中六胺銀染液染色時(shí)間過(guò)短，隱球菌尚未完全著色，染色過(guò)淺，與背景顏色相近，不易觀察。此外，此時(shí)隱球菌隱約可見空心狀，容易與紅細(xì)胞混淆，影響診斷。B組中六胺銀染液染色時(shí)間適中，隱球菌呈黑色空心狀，空心部分為隱球菌的莢膜，不著色，也是隱球菌在六胺銀染色中的一大特點(diǎn)。此時(shí)背景成淡藍(lán)色，周圍肺纖維組織呈淡棕色至棕色，與隱球菌形成鮮明的色差，容易觀察。C組中六胺銀染液染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，周圍組織已經(jīng)逐漸染成黑褐色，與隱球菌重疊、分界不清，隱球菌深染成團(tuán)塊狀，少見空心部分，不易于觀察，影響診斷。作者旨在通過(guò)實(shí)驗(yàn)，在原有六胺銀染色方法的基礎(chǔ)上，探索一種染色效果好、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、染色時(shí)間較短、減少染液污染顯微鏡、染色方法可重復(fù)性高的六胺銀染色方法。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)B組的六胺銀染色方法是最符合本研究初衷的技術(shù)方法。作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，B組的染色結(jié)果：隱球菌染成空心黑色，周圍肺纖維組織呈淡棕色至棕色，隱球菌與周圍肺纖維組織染色可謂對(duì)比清晰，但是，如果再將馬松三色套染于B組的方法上，則隱球菌依然染成空心黑色，而周圍肺纖維組織可能被染成綠色，如此將使周圍肺纖維組織染色更加艷麗，與隱球菌染色對(duì)比更加清晰，更有助于肺隱球菌病的診斷。

綜上所述，在用于診斷肺隱球菌病的病理切片行六胺銀染色時(shí)，其他反應(yīng)條件不變的情況下，六胺銀染液作用步驟采用在水溫箱60℃溫育30～35min，染色評(píng)分結(jié)果得分高，效果好，肺隱球菌病診斷準(zhǔn)確率高，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便，染色時(shí)間較傳統(tǒng)方法短，可減少染液污染顯微鏡，染色方法可重復(fù)性高，值得推薦。