甘草次酸保肝功效的通路作用機制

楊曉宇，蘇秀蘭

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，呼和浩特 010050）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）屬多年生草本，是一種廣受歡迎的中草藥，其根和根莖具有多種藥用價值，是近2000年來廣泛使用的傳統(tǒng)藥物之一[1,2]。由于甘草在調(diào)節(jié)草藥性質(zhì)和促進排毒方面具有一定作用，因此，在具有一定毒性作用藥物的應(yīng)用中常將甘草加入減毒。

甘草次酸[3]（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草的主要成分，由甘草酸水解脫去糖酸鏈而形成。GA具有抗過敏，抗病毒和抗炎活性；可以調(diào)節(jié)胰島素分泌并改善葡萄糖耐量；GA還可抑制原癌細(xì)胞的信息傳遞和基因表達。甘草次酸對多種致癌物誘導(dǎo)的實驗動物惡性腫瘤均有抑制作用。甘草次酸還具有抗病毒感染的作用，對致癌性的病毒如肝炎病毒，EB病毒及艾滋病毒的感染均有抑制作用。

以往的研究表明，GA在幾種肝損傷模型中具有肝保護作用[4]，如游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝臟脂毒性，四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷和膽汁酸引起的肝毒性[5,6]。然而，目前還沒有關(guān)于GA在不同信號通路中發(fā)揮保肝作用可能機制的報道。

肝炎是全球死亡的主要原因之一，其由各種肝毒性物質(zhì)引起。 它可導(dǎo)致肝纖維化，肝硬化并增加肝細(xì)胞癌的發(fā)生率。目前對肝炎的藥物治療常常受到有效性和安全性的限制。因此，尤其是從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)副作用小的制劑是全世界范圍的焦點。幾項臨床研究報道，GA可有效治療各種類型的炎癥（主要在肝），還包括肺、腎、腸和脊髓。 GA最常見的用途是治療肝病，包括GA可顯著降低肝細(xì)胞脂肪變性和壞死，抑制間質(zhì)炎癥和肝纖維化，促進細(xì)胞再生。GA具有很少的副作用，因此被認(rèn)為是值得關(guān)注和治療肝病的藥物[7]。

爆發(fā)性肝損傷（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF），又稱爆發(fā)性肝衰竭，是一種危及生命的臨床綜合征，伴隨著與肝酶升高、肝性腦病、凝血病和多器官功能衰竭相關(guān)的肝細(xì)胞功能急劇下降。急診肝移植可以有效治療FHF，但移植后的結(jié)果與受者年齡、移植前疾病的嚴(yán)重程度以及所用移植物的性質(zhì)有關(guān)。因此找到有效的治療方法來穩(wěn)定和延緩FHF的發(fā)展至關(guān)重要。GA的作用已經(jīng)日益引起研究人員及臨床工作者的關(guān)注。

1 GA通過NF-κB和p-38 MAPK信號通路發(fā)揮保護作用

普遍認(rèn)為NF-κB信號通路的激活在急性肝損傷過程中起著至關(guān)重要的作用。對利用D-Gal / LPS（D-半乳糖/脂多糖）建立的急性肝炎模型組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NF-κB可增強與DNA結(jié)合活性。NF-κB在調(diào)節(jié)全身性炎癥中發(fā)揮重要作用，其活化受核因子κB抑制蛋白（nuclear factor-kappa B，IkB)激酶（IKK）復(fù)合物控制。在炎癥過程中，IkB磷酸化的誘導(dǎo)通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)導(dǎo)致IkB降解，游離的NF-κB然后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并與其靶基因的結(jié)合位點結(jié)合，如iNOS和TNF-a，從而促進基因表達和許多炎癥介質(zhì)的釋放[8]。其中，促炎細(xì)胞因子TNF-α、iNOS和環(huán)氧化酶-2（COX-2）釋放級聯(lián)在肝損傷的發(fā)病和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[9]。

NF-κB是炎癥過程中的關(guān)鍵信號分子，導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)和許多促炎性細(xì)胞因子釋放，從而擴大炎癥級聯(lián)并導(dǎo)致FHF損傷。目前的研究結(jié)果表明，在異甘草酸鎂（magnesium Isoglycyrrhizinate,MgIG）與D-Gal/LPS誘導(dǎo)的肝臟炎癥中，NF-κBp65蛋白水平降低，而GA可以顯著改善肝臟炎性環(huán)境，表明NF-κB活化的抑制至少部分與GA的抗炎活動相關(guān)。p38-MAPK可以激活多種炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[10]，如NF-κB，可能在調(diào)節(jié)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。例如，p38-MAPK可通過控制NF-κB活化來調(diào)節(jié)D-GalN/ LPS誘導(dǎo)的炎癥過程。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38-MAPK構(gòu)成MAPK家族[12]。MAPKs特別是p38-MAPK的持續(xù)激活可能在調(diào)節(jié)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)尤其是NF-κB信號通路中發(fā)揮重要作用[13]。在D-Gal / LPS誘導(dǎo)急性肝臟炎癥的研究中，GA可以激活p38-MAPK激酶減弱D-Gal / LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)從而啟動 NF-κB 信號通路來表現(xiàn)出抗炎作用。

AP-1和NF-κB是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如TNF-α，IL-6和IL-8表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，TNF-α反過來促進AP-1和NF-κB的活化，從而使信號通路有可能擴增。AP-1在MAPK信號傳導(dǎo)的下游[14]，其包括細(xì)胞外受體激活的激酶（ERK），c-jun N端激酶（JNK）和p38。然而，p38是涉及LPS信號傳導(dǎo)的主要MAPK家族成員，并負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞凋亡和壞死。重要的是，巨噬細(xì)胞中TNF-α[15]的表達需要p38 MAPK的表達，GA可以抑制巨噬細(xì)胞中AP-1和NF-κB的LPS誘導(dǎo)的啟動子活性。另外，GA預(yù)處理顯著抑制了肝組織中p-p38 MAPK和p-IκB的升高。由此表明，GA可以有效抑制LPS激活的p38 MAPK和NF-κB信號通路[16]。

2 GA通過HMGB1-TLR4信號通路發(fā)揮保護作用

TLR4 / MD2復(fù)合物識別LPS是LPS / D-GalN誘導(dǎo)的FHF的起始事件。TLR4是一種跨膜受體蛋白，主要位于肝臟中巨噬細(xì)胞和枯否細(xì)胞的表面，已知它是分泌TNF-α并驅(qū)動FHF的關(guān)鍵細(xì)胞。 由IRAK-1、IRAK-2、IRAK-4和IRAK-M組成的IRAK家族在TLR4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。在這些分子中，IRAK-1和IRAK-4兩種被磷酸化激活的活化激酶可引起NF-κB和MAPKs信號通路的激活。IRAK-1或4缺陷小鼠對內(nèi)毒素的致死作用具有抗性，IRAK-1或缺陷型巨噬細(xì)胞對LPS不敏感，TNF-α產(chǎn)生減少[17]。在TLR4觸發(fā)后，TLR4開始將IRAK-4募集到MyD88，隨后它們被招募到復(fù)合物中，然后引起IRAK-4自磷酸化和IRAK-1和IRAK-2的磷酸化。此外，一旦磷酸化，IRAK-1與TRAF6相互作用，將MyD88解離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)以激活下游信號通路[16]。因此，有人假設(shè)GA的保護作用會影響IRAK-1的活性。GA抑制IRAK-1和TRAF6之間的LPS誘導(dǎo)的相互作用，但不影響IRAK-1的表達，表明GA的分子靶標(biāo)可能涉及IRAK。事實上，除了兩種活性激酶之外，IRAK-2也是控制TLRs信號通路的重要激酶，但其作用仍有爭議。眾所周知，白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白激酶M抗原（interleukin 1 receptor associated protein kinase M antigen, IRAKM）是發(fā)揮TLR4信號傳導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子的關(guān)鍵失活激酶。IRAK-M可抑制IRAK4從MyD88的解離并阻止IRAK-1 / TRAF復(fù)合物的形成。IRAK-M的上調(diào)與內(nèi)毒素耐受性密切相關(guān)，內(nèi)毒素耐受是抵抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵保護機制，IRAK-M敲除小鼠更容易受到細(xì)菌感染。研究發(fā)現(xiàn)GA在體內(nèi)和體外均可上調(diào)IRAK-M的表達。然而，IRAK-M的表達也可以被一些炎癥刺激因子如LPS，TNF-α上調(diào)。有研究顯示沉默巨噬細(xì)胞中的IRAK-M基因表達，GA預(yù)處理未能抑制IRAK-M缺陷型巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，表明GA對抗LPS / D-GalN誘導(dǎo)的FHF的潛在保護機制與IRAK-M的上調(diào)相關(guān)。這一作用也可以解釋為什么TLR4和IRAK-1表達水平不受GA影響。

此外，在人和小鼠FHF中，浸潤的單核細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞，是TNF-α的主要來源。用抗TNF-α抗體治療阻止LPS / D-GalN誘導(dǎo)的小鼠死亡，TNF-α敲除顯著減弱LPS / D-GalN誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，GA通過抑制促炎細(xì)胞因子如TNF-α，IFN-α和MIP-1α來緩解痤瘡丙酸桿菌和LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷。這些研究結(jié)果均提示IRAK-M可能是GA保肝作用的關(guān)鍵分子靶點。同時，作為重要的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs），高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）由壞死和凋亡的肝細(xì)胞釋放，并激活先天免疫TLR4信號通路[18]。壞死肝細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和DNA，可與相應(yīng)的模式識別受體結(jié)合，激活初始免疫系統(tǒng)并釋放過量炎癥介質(zhì)，最后導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷，GA可以與HMGB1受體競爭性結(jié)合從而使HMGB1-TLR4失活達到保肝功效。

3 GA通過Nrf2 / ARE信號通路發(fā)揮保護作用

在藥物引起的肝毒性中，氧化應(yīng)激伴隨著氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子核E2相關(guān)因子2（Nrf2）的抑制。已報道GA通過激活Nrf2途徑來防止大鼠中的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的肝毒性。正常情況下，Nrf2錨定在細(xì)胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激導(dǎo)致Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活多個細(xì)胞保護基因[19]。Nrf2通路現(xiàn)在被認(rèn)為是一種重要的抗氧化信號通路[20]，它也參與減輕炎癥反應(yīng)，如下調(diào)NF-κB通路和炎性細(xì)胞因子包括TNF-α，IL-1β和IL-6[21]。有研究表明GA可以通過Nrf2途徑保護HepG2細(xì)胞免于TP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，是由于GA可以通過特異性抑制還原型輔酶 II (nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, NADPH) 氧化酶的活性減少ROS類物質(zhì)釋放，以及調(diào)節(jié) PI3K/AKT信號通路，最終降低凋亡細(xì)胞比例[22]。

活性氧（ROS）誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是肝損傷的重要機制。ROS是含氧的高反應(yīng)性分子，可以修飾DNA和蛋白質(zhì)。在正常條件下，ROS通過抗氧化防御系統(tǒng)平衡，包括SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）。當(dāng)氧化劑和抗氧化劑之間發(fā)生不平衡時，就會達到氧化應(yīng)激。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過肝臟中的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）調(diào)節(jié)一系列解毒和抗氧化防御基因表達[23]。Nrf2控制數(shù)百個ARE依賴基因的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)表達，以調(diào)節(jié)氧化劑暴露的生理和病理生理學(xué)結(jié)果。 許多研究證明，Nrf2可阻止肝臟中的各種肝臟毒性物質(zhì)，Nrf2信號通路是保護肝臟免受乙醇等物質(zhì)誘導(dǎo)的損傷的重要靶點[24]。例如，在細(xì)胞受到有害物質(zhì)刺激后， Nrf2會特異性轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，然后上調(diào)血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1,HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化（GCLC）、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾物（GCLM）和醌氧化還原酶（NQO1），從而達到保護細(xì)胞的作用[25]；當(dāng)細(xì)胞被ROS或其他親核試劑刺激時，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，激活靶基因的表達，調(diào)節(jié)II期代謝酶，抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性或藥物轉(zhuǎn)運蛋白，從而發(fā)揮抗氧化損傷[26]。

Nrf2 / ARE信號通路在肝病理生理學(xué)中的作用以及Nrf2作為治療靶點治療病毒性肝炎、酒精性和非酒精性肝病以及纖維化的潛在應(yīng)用已有詳細(xì)報道。幾種天然抗氧化劑不僅通過清除自由基，而且通過Nrf2信號通路增強細(xì)胞保護性和/或抗氧化基因的表達來發(fā)揮保肝作用。通常，Nrf2通過Kelth樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）被束縛在細(xì)胞質(zhì)中，用于隨后的蛋白酶體降解。在誘導(dǎo)物刺激下，Nrf2從Keap1解離并轉(zhuǎn)移到核中，在核中它結(jié)合編碼許多抗氧化酶和II期解毒酶的靶基因的ARE[27]。這將導(dǎo)致激活I(lǐng)I期解毒酶，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）[28]、NQO1、HO-1，可有效保護哺乳動物細(xì)胞免受各種毒物的傷害。

4 結(jié)語

已有大量研究表明，GA可以通過調(diào)節(jié)肝臟疾病的各種分子途徑來發(fā)揮其保護肝臟的功能。本文總結(jié)了GA通過不同信號通路發(fā)揮保肝作用的機制（圖1），預(yù)計未來的多學(xué)科聯(lián)合研究將有助于確定肝損傷的各種分子機制和靶點。目前，用GA進行多中心、大樣本、隨機、雙盲的臨床試驗數(shù)量非常有限，仍然需要廣泛的臨床研究來評估GA單獨使用或聯(lián)合配伍使用的安全性和化學(xué)預(yù)防功效。

圖1 GA在不同信號通路中的作用示意圖Fig. 1 Diagram showing the role of GA in different signaling pathways