神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Hsp27的表達(dá)及其與化療藥物關(guān)系的研究*

熱休克蛋白（heat shock protein，HSPs）［1］根據(jù)分子量分為不同家族，在蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡過程中起到分子伴侶的作用。熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）［2-3］是其中一員，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理過程；受到高溫、缺氧、藥物等刺激時，表達(dá)誘導(dǎo)型Hsp27，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的信號通路發(fā)揮細(xì)胞保護作用。有報道Hsp27參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程［2］，其高表達(dá)與胸腺上皮腫瘤［4］、星形膠質(zhì)瘤［5］、食管腺癌［6］、肝癌［7］、涎腺腺樣囊性癌［8］、喉鱗狀細(xì)胞癌［9］、膀胱癌［10］及多發(fā)性骨髓瘤［11］預(yù)后不良相關(guān)，但與食管癌［12］、子宮內(nèi)膜癌［13］和肺癌［14］的良好預(yù)后相關(guān)。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是起源于胚胎性交感神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)嵴的交感神經(jīng)胚胎性腫瘤，是兒童最常見的顱外實體腫瘤［15］。NB極易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥，占兒童癌癥死亡率的15%［16］。根據(jù)國際神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理學(xué)分類（INPC）［17-18］，分為NB、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤（ganglioneuroblastoma，GNB）和節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤（ganglioneuroma，GN），其中GN為良性腫瘤，NB/GNB為惡性腫瘤。盡管使用手術(shù)、化療、放療、自體骨髓移植、生物制劑等多模式治療方案使NB患兒治療效果有所改善，但高危患兒的長期生存率仍較低?；熕幬锬退幨歉呶；純褐委熓〉年P(guān)鍵原因之一，并且患者可能出現(xiàn)顯著的早期或晚期毒性，進(jìn)一步限制了常規(guī)化療劑量增強。近年研究表明，個體遺傳基因表達(dá)的差異及基因多態(tài)性是造成藥物反應(yīng)個體差異的主要原因［19］，通過檢測藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)，能夠預(yù)測腫瘤化療藥物敏感性及毒副反應(yīng)。

因此，本研究首先檢測Hsp27在NB中的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；構(gòu)建耐藥細(xì)胞株，檢測Hsp27 表達(dá)差異；檢測常規(guī)化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)，以預(yù)測化療藥物的敏感性及毒副反應(yīng)；進(jìn)一步分析Hsp27 的表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系，為評估NB/GNB的預(yù)后提供新指標(biāo)，同時為NB/GNB尋找新的潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2012年4月至2019年5月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院確診神經(jīng)母細(xì)胞瘤新鮮切除的手術(shù)或手術(shù)活檢標(biāo)本。其中男性79 例，女性55 例，中位年齡3 歲（16 天至11 歲）。NB 分期、危險度分組等參照2015 版《兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤診療專家共識》［20］。本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查［（2017）年倫審（研）第（40）號］，已獲得被研究對象或其家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）、胎牛血清（購自美國Gibco公司）、順鉑（購自大連美侖生物公司MB1055）、胰蛋白酶（購自美國Gibco公司）、CCK-8（購自日本同仁公司）、RNA提取試劑盒（購自中國Bio Teke 公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TaKaRa公司）、TB Green Ⅱ熒光染料（購自日本TaKaRa公司）、Hsp27引物（購自上海生工生物公司）、β-acting引物（購自上海生工生物公司）、兔Hsp27單克隆抗體（購自美國Abcam公司，ab2154）、免疫組織化學(xué)超敏二步法試劑盒（購自北京中杉金橋公司）、DAB顯色試劑盒（購自北京中杉金橋公司）、CFX96 Cycler熒光定量PCR儀（購自美國BIO-RAD公司）、顯微鏡（Nikon E800，分析軟件NIS-ELEMENtS br.3.0）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人NB 細(xì)胞系SH-SY5Y 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DEME 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。采用低濃度長時間誘導(dǎo)法干預(yù)SH-SY5Y：用完全培養(yǎng)基根據(jù)化療藥物的峰值血漿濃度（peak plasma concentration，PPC）（順鉑CDDP：3 μg/mL［21］）配制培養(yǎng)基；從初始濃度0.1×PPC 開始，以1.25～1.5 倍的梯度逐步提高化療藥物濃度，直至1×PPC濃度；每個濃度孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，換用不含化療藥物的完全培養(yǎng)基，待其恢復(fù)生長后，重復(fù)1次；反復(fù)換液、傳代，最終將細(xì)胞維持培養(yǎng)于含1×PPC濃度化療藥物的培養(yǎng)基中，常規(guī)凍存。

1.2.2 CCK-8法檢測耐藥性 取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后用完全培養(yǎng)基重懸為4×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，100μL/孔，培養(yǎng)24 h后，配制含CDDP的完全培養(yǎng)基，按照藥物的PPC稀釋成不同濃度梯度（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 PPC），用含藥培養(yǎng)液置換孔中的培養(yǎng)液，設(shè)空白組、對照組，每個濃度重復(fù)3孔，培養(yǎng)48 h，棄孔中培養(yǎng)液，加入含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)液100μL，37℃孵育1～2 h，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率（%）=（OD空白孔-OD待測孔）/（OD空白孔-OD調(diào)零孔）×100%，計算半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50），耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=IC50（耐藥細(xì)胞）/IC50（親本細(xì)胞）。

1.2.3 RT-qPCR法檢測Hsp27基因mRNA的表達(dá) 采用離心柱法提取NB組織、親代及耐藥細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，采用TB GreenⅡ熒光染料qPCR 法分別擴增Hsp27cDNA（Forward 5'-CAAGGATGGCGTGGTGGAG ATC-3'，Reverse5'-CTCGTTGGACTGCGTGGCTAG-3'），以人β-actin為內(nèi)參基因（Forward 5'-CCTGGCACCCAG CACAAT-3'，Reverse 5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'），在CFX96 Cycler熒光定量PCR儀上運行。每份標(biāo)本設(shè)定3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次；采用2-ΔΔCt法計算Hsp27基因表達(dá)水平。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測NB組織中Hsp27蛋白的表達(dá) 石蠟包埋，連續(xù)組織切片，厚度為4.5μm，60℃烘烤后進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗。經(jīng)脫蠟、檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育阻酶，0.5%BSA 封閉，滴加兔Hsp27 抗體4℃過夜，經(jīng)免疫組織化學(xué)試劑盒反應(yīng)增強液和二抗依次作用后，DBA 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下讀片。

結(jié)果判斷：Hsp27 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以胞核、胞質(zhì)棕黃色顆粒沉著為陽性表達(dá)。染色范圍：整張切片內(nèi)陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比例，陽性細(xì)胞＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3 分。染色強度：不顯色0 分，淡黃色1 分，棕黃色2分，棕褐色3分。染色范圍結(jié)合染色強度（染色范圍×染色強度=免疫組織化學(xué)結(jié)果）來判斷Hsp27 表達(dá)程度：0分（-），1、2分（+），3、4分（++），9、6分（+++）。

1.2.5 腫瘤標(biāo)本化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)檢測 18例NB/GNB 的石蠟包埋組織標(biāo)本送至上海復(fù)旦臨床病理診斷中心，分別采用IHC、PCR 擴增測序法檢測常規(guī)藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)的表達(dá)或突變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；Kaplan-Meier生存曲線分析生存及預(yù)后資料。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥株構(gòu)建情況

通過低濃度長時間誘導(dǎo)法，歷時5個月成功構(gòu)建耐順鉑細(xì)胞，命名SH-SY5Y/CDDP，耐藥指數(shù)＞10倍（表1）。

表1 細(xì)胞對化療藥物敏感性比較

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測NB組織中Hsp27蛋白表達(dá)

Hsp27在NB組織中陽性率為72.22%（65/90），在GNB組織中陽性率為37.5%（9/24），在GN組織中陽性率為0（0/20），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=45.442，P＜0.001，表2，圖1）。

在NB/GNB 組織中Hsp27 蛋白陽性表達(dá)與腫瘤分期、危險度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），與患兒的年齡、性別、Shimada 組織學(xué)分型、N-myc 有無擴增差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）?；熀蟮哪[瘤組織Hsp27表達(dá)較化療前增高6例，降低5例，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

表2 Hsp27蛋白與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3 NB組織和細(xì)胞中Hsp27 mRNA的表達(dá)

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，Hsp27 mRNA 在59 例NB/GNB 中表達(dá)量為3.763±1.854，在5 例GN 中表達(dá)量為2.476±0.698（P＞0.05，圖2）。

Hsp27 mRNA 表達(dá)量在SH-SY5Y/CDDP 中 較SH-SY5Y 顯著增高（3.902±0.331vs.1.015±0.061，F(xiàn)=16.246，P＜0.01，圖3）。

2.4 Hsp27 蛋白在NB 組織中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

將NB組織中的Hsp27蛋白表達(dá)水平作為因變量繪制Kaplan-Meier 生存曲線（圖4），結(jié)果顯示Hsp27陰性表達(dá)患者的生存率（84.4±10.4）%明顯高于陽性表達(dá)患者（70.0±7.9）%，χ2=4.22，P＜0.05。

圖1 Hsp27在各組織中的表達(dá)（DBA染色×400）

表3 20例化療前后NB/GNB組織中Hsp27蛋白表達(dá)情況

圖2 Hsp27 mRNA在NB組織中的表達(dá)

圖3 Hsp27 mRNA在NB細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 NB/GNB總體生存曲線

2.5 標(biāo)本化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)檢測結(jié)果

本研究共檢測18例NB/GNB腫瘤標(biāo)本的常規(guī)7個化療藥物敏感性分子靶標(biāo)：ERCC1、TOPOⅠ、TOPOⅡA、MGMT、CYP2C19*2、CYP2B6*6、UGT1A1*28（表4）。分析Hsp27蛋白表達(dá)與化療藥物敏感性及毒性關(guān)系發(fā)現(xiàn)（表5），Hsp27蛋白在鉑類化療藥物敏感性較低組的陽性表達(dá)率61.5%（8/13）明顯高于敏感性較高組0（0/5），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.538，P＜0.05），而Hsp27在環(huán)磷酰胺、伊立替康/拓?fù)涮婵?、蒽環(huán)類/依托泊苷、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性較高組與較低組及環(huán)磷酰胺、伊立替康/拓?fù)涮婵刀靖狈磻?yīng)較強組與較弱組的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)檢測結(jié)果

表5 Hsp27表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系

3 討論

本研究主要通過探討NB中Hsp27蛋白及基因水平的表達(dá)差異，分析找到NB 新的預(yù)后/診斷標(biāo)志物。結(jié)果顯示，Hsp27在NB/GNB腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤分期、危險度、轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，可能參與NB/GNB 的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移，為國內(nèi)首次報道Hsp27 與NB的關(guān)系。

Hsp27與腫瘤關(guān)系密切，諸多文獻(xiàn)已證明其與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展、參與治療耐受性及抑制細(xì)胞凋亡。但是這一結(jié)論在相同或不同腫瘤組織中報道不同。Nakajima 等［22］通過對62例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27高表達(dá)與腫瘤的浸潤深度和病理分期呈負(fù)相關(guān)，與淋巴結(jié)浸潤呈正相關(guān)。但Kawanishi 等［23］研究認(rèn)為Hsp27的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤深度和分期無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。Zhang等［24］發(fā)現(xiàn)Hsp27在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。Eto等［25］通過194例肝細(xì)胞癌樣本發(fā)現(xiàn)HSP27表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后無相關(guān)性，但對142例丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）陽性組的分析發(fā)現(xiàn)，磷酸化HSP27 陽性的腫瘤直徑較大，門靜脈侵犯率較高。Liang等［7］研究發(fā)現(xiàn)Hsp27高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)病率、甲胎蛋白水平、病理分級呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

國際上目前有兩項研究檢測了少量病例中NB的Hsp27 表達(dá)，但國內(nèi)鮮見相關(guān)報道。Ungar 等［26］通過對53例NB標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)與臨床分期、N-myc 擴增呈負(fù)相關(guān)。Zanini 等［27］通過對26 例NB/GNB標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)與預(yù)后良好呈正相關(guān)，與侵襲性呈負(fù)相關(guān)。與本研究關(guān)于該蛋白質(zhì)與NB的關(guān)系結(jié)論不一致，本研究認(rèn)為造成這種差異的原因主要為：1）用于評估Hsp27 的方法有關(guān)，評估伴侶蛋白表達(dá)在腫瘤相關(guān)疾病預(yù)后作用的一個重要問題是腫瘤細(xì)胞中磷酸化伴侶蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位信息欠明確；2）NB具有顯著異質(zhì)性及組織學(xué)多樣性，在同一NB 樣本中，通常包含不同程度成熟的區(qū)域，癌癥的不同區(qū)域呈非均勻蛋白質(zhì)表達(dá)；3）另外兩項研究［26-27］均未探索Hsp27 在GN 中的表達(dá)情況，且樣本量較小，臨床病理參數(shù)隊列信息不完善；4）前兩項研究［26-27］患者來源分別為美國及意大利，均為歐美人種，本研究病例標(biāo)本來自中國，患者均為亞洲人種；5）可能與Hsp27抗體有關(guān)，Hsp27活性取決于其寡聚化、磷酸化狀態(tài)。具體差異原因仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)實驗證明。

有研究［2］報道受化療藥物刺激，Hsp27 表達(dá)應(yīng)激后增加。本研究比較了20 例化療前后NB/GNB 組織中Hsp27 的表達(dá)情況，隨著化療進(jìn)程，Hsp27 表達(dá)增高6 例（6/20），降低5 例（5/20），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與檢測樣本量較小相關(guān)，后期將擴大樣本量，驗證該觀點。

有研究［28-29］表明Hsp27 參與腫瘤對化療的耐受性，如Hsp27 在耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的結(jié)腸癌細(xì)胞［30］、耐長春新堿的胃癌［31］、耐吉西他濱的胰腺癌中高表達(dá)［32］；抑制Hsp27可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對化療藥物的耐藥性［33］，降低肺腺癌對吉西他濱敏感性［34］，因此用適當(dāng)?shù)囊种苿┌邢騂sp27可能是理想的腫瘤治療靶點［35］。

本課題組前期研究［36-37］發(fā)現(xiàn)，通過檢測藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)，可以預(yù)測腫瘤的化療藥物敏感性及毒副反應(yīng)，根據(jù)檢測結(jié)果實施個體化化療方案能夠有效縮減瘤體，減少術(shù)前化療療程，減輕化療毒副反應(yīng)。本研究通過RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)Hsp27 mRNA表達(dá)在耐順鉑的細(xì)胞中比親代細(xì)胞高，說明NB獲得性耐藥與Hsp27 有關(guān)。為進(jìn)一步在體內(nèi)驗證Hsp27 表達(dá)與耐藥的關(guān)系，本研究初步檢測18 例NB/GNB 常用化療藥物相關(guān)性分子靶標(biāo)，預(yù)測其對藥物的敏感性及毒副反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)此18 例NB/GNB 對鉑類、伊立替康/拓?fù)涮婵怠⑤飙h(huán)類/依托泊苷、環(huán)磷酰胺、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀的敏感性不高。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Hsp27表達(dá)增高與鉑類藥物耐藥相關(guān)，與細(xì)胞實驗一致，這為研究化療藥物耐藥靶點提供了新的思路，但仍需在動物實驗中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究通過初步探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞中Hsp27 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hsp27 在NB/GNB高表達(dá)，并與腫瘤分期、危險度、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、鉑類藥物耐藥相關(guān)，可能參與了NB/GNB的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移耐藥。因此，本研究可能為NB的靶向治療尋求到新的標(biāo)志物，但仍需擴大樣本量及進(jìn)一步基礎(chǔ)研究證明。