免疫膠體金試紙法驗證甲狀旁腺的臨床應用研究*

甲狀腺癌發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢［1］，根據(jù)最新數(shù)據(jù)，其發(fā)病率已上升為中國惡性腫瘤人群第10 位，更是城市女性中發(fā)病風險較高的癌癥之一［2］。甲狀腺腫物以手術切除為主，術中誤傷甲狀旁腺造成的低鈣血癥是重要并發(fā)癥。2018年美國甲狀腺學會關于成人患者術后甲狀旁腺功能減退癥的診斷、預防及管理聲明［3］指出雙側（同期或分期）甲狀腺切除術最易導致術后低鈣血癥，隨甲狀旁腺枚數(shù)的減少，低鈣血癥的發(fā)生率將逐漸增高［4］。

利用術中免疫膠體金試紙法快速測定組織內甲狀旁腺素（PTH）水平，從而提高甲狀旁腺辨識度，相關研究國內外鮮見報道。本研究借助免疫膠體金技術，術中細針穿刺法穿刺待測組織，獲取洗脫液并利用該便攜式儀器及配套試紙快速得到檢驗結果，利用術中病理冰凍、術前術后PTH及血鈣水平、患者癥狀等，觀察術中識別甲狀旁腺的敏感度、特異度、準確性等，分析該技術可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年9月至2018年12月于云南省腫瘤醫(yī)院接受雙側甲狀腺全部切除患者進行前瞻性研究，共130例患者進行雙側甲狀腺手術切除術。同時收集2015年1月至2016年1月同單位采用納米碳技術行雙側甲狀腺全切患者資料。所有手術均由同一組醫(yī)生操作完成。相關手術及PTH檢測均經云南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會備案，患者及家屬均知情同意。將使用膠體免疫金試紙法進行術中PTH快速檢測定義為試驗組（74 例），使用納米碳負顯影技術識別甲狀旁腺定義為對照組1（50例），常規(guī)肉眼法識別甲狀旁腺定義為對照組2（56例）。

試驗組和對照組1、對照組2 中央?yún)^(qū)淋巴結清掃范圍為上界至甲狀軟骨，下界達胸腺，外側界為頸動脈鞘內側緣，包括氣管前、氣管旁、喉前淋巴結。3組患者清掃范圍無差異。3 組患者手術中因解剖位置特殊或位于中央?yún)^(qū)淋巴結造成手術游離后血供較差，原位保留難以保證其功能者，均行甲狀旁腺自體移植。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 預期進行雙側甲狀腺全切患者知情同意后納入研究。術中采用雙極、超聲刀、電刀等器械綜合運用的方法，在甲狀腺表面剝離甲狀旁腺時，手法輕柔，不用力牽拉，避免使用吸引器，以免將其拽下或誤吸。根據(jù)精細化解剖，常規(guī)在甲狀腺背側據(jù)臨床經驗顯露甲狀旁腺，上旁腺通常位置固定，位于甲狀腺后懸韌帶區(qū)域，靠近食管后外側緣，多在Zuckerkandle 結節(jié)后可發(fā)現(xiàn)上旁腺。而下甲狀旁腺，變異較大，可位于甲狀腺后緣中下1/3 交界范圍，甲狀腺前、甲狀腺內、胸腺內或縱隔內，極易與脂肪或淋巴結混淆，因此主要進行下甲狀旁腺鑒別。

對需要檢測的可疑組織（圖1）分別用1 mL無菌注射器，內含0.2 mL生理鹽水帶負壓穿刺并抽吸目標組織3次（圖2），并將上述針頭在0.8 mL生理鹽水中反復抽吸3次，取上述洗脫液95μL，滴加在免疫膠體金試紙條加樣區(qū)，孵育10 min，反應完成后定性觀察反應區(qū)條帶；檢測儀開機后，采用PTH常規(guī)檢驗模式，將加樣后的試劑條置于檢測區(qū)域讀取PTH結果。由同一位醫(yī)生加樣和操作儀器進行PTH檢測。每次免疫膠體金試紙法檢測PTH耗時12～15 min，包括取樣、加樣、孵育、測量、讀值等步驟，其中孵育部分耗時10 min。

圖1 箭頭處為需要進行鑒定的可疑甲狀旁腺組織

1.2.2 結果判讀 若試紙條顯示出1條條帶，則檢測結果為陰性，既該組織為非甲狀旁腺組織；若試紙條出現(xiàn)2 條條帶，則檢測結果為陽性，既該組織為甲狀腺旁組織。根據(jù)設備使用說明，得到PTH值，若PTH值＞65 ng/mL，檢測結果為陽性，考慮該組織為甲狀旁腺組織；若PTH 值≤65 ng/mL，則檢測結果為陰性，考慮穿刺組織為非甲狀旁腺組織。

1.3 統(tǒng)計學分析

以術中冰凍病理為金標準，甲狀旁腺術中快速檢測的敏感度與特異度的計算方法。真陽性=TP（ture positive）：準確鑒定的甲狀旁腺組織，即PTH＞65 pg/mL且冰凍病理證實為甲狀旁腺組織。真陰性=TN（ture negative）：準確鑒定的非甲狀旁腺組織，即PTH≤65 pg/mL且冰凍病理證實為非甲狀旁腺組織。假陽性=FP（false positive）：非甲狀旁腺組織鑒定為甲狀旁腺組織。即PTH＞65 pg/mL 而冰凍病理證實為非甲狀旁腺組織。假陰性=FN（flase negative）：甲狀旁腺誤診為非甲狀旁腺，即PTH≤65 pg/mL而冰凍病理證實為甲狀旁腺組織。敏感度（真陽性率）=TP/（TP+FN）；特異度（真陰性率）=TN/（TN+FP）；誤診率（假陽性率）=FP/（TN+FP）；漏診率（假陰性率）=FN/（TP+FN）。

圖2 穿刺抽吸可疑組織：用1 mL無菌注射器，內含0.2 mL生理鹽水帶負壓穿刺并抽吸目標組織

采用系統(tǒng)隨機化法分組：常規(guī)肉眼組應用常規(guī)方法肉眼識別甲狀旁腺（對照組2），免疫膠體金試紙法組患者加用免疫膠體金技術識別甲狀旁腺（試驗組），納米碳組加用納米碳技術識別甲狀旁腺（對照組1）。分別于術前及術后第1 天常規(guī)檢測兩組血清PTH水平及鈣離子水平，比較兩組甲狀旁腺功能減退發(fā)生率及低鈣反應率，統(tǒng)計納米碳組同樣數(shù)據(jù)。

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用表示。符合率用百分率（%）表示，組間比較采用t檢驗，配對四格表比較兩個總體率用Fisher 確切概率法檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 可行性

免疫膠體金可定性及定量判讀結果，PTH＜65 ng/mL時，試紙檢測線不顯色；PTH 值≥65 ng/mL 時，檢測線顏色深淺與樣品中的PTH含量呈正比，即含量越高，顏色越深。使用免疫膠體金試紙法76 例患者共117例樣本中，有效穿刺117 例，相符率100%，說明由甲狀腺外科專業(yè)組醫(yī)師進行術中穿刺檢測的操作，成功率高，且試紙穩(wěn)定。

2.2 特異度和敏感度

以冰凍病理結果為“金標準”，在Ⅵ區(qū)淋巴結清掃標本中常規(guī)尋找旁腺組織（圖3），或將術中不能辨別的可疑組織行細針穿刺，若為甲狀旁腺，則原位保留。

圖3 在Ⅵ區(qū)淋巴結清掃標本中常規(guī)尋找旁腺組織

免疫膠體金試紙法判斷甲狀旁腺真陽性率（敏感度）為TP/（TP+FN）=74/76=97.4%；假陽性率（誤診率）為FP/（TN+FP）=0/41=0；真陰性率（特異度）為TN/（TN+FP）=41/41=100%；假陰性率（漏診率）為FN/（TP+FN）=2/76=2.63%；準確率為115/117=98.3%（表1）。

表1 免疫膠體金PTH測試與病理診斷效度分析

2.3 甲狀旁腺附近頸部不同組織內PTH表達

76 份病理證實的甲狀旁腺，其中74 份PTH 值＞65 pg/mL，范圍62.1～1 340.6 pg/mL，兩份PTH＜65 pg/mL（均＞60 pg/mL）。其余41例非甲狀旁腺包括脂肪、淋巴結等PTH值均＜65 pg/mL。甲狀旁腺組織PTH值與甲狀腺、脂肪、淋巴結的PTH 值均呈正態(tài)分布，采用配對t檢驗，甲狀旁腺組織與其他任一組織相比較，PTH 值差異較大，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），甲狀旁腺PTH值遠高于其他3種組織（表2）。

表2 甲狀旁腺組織與脂肪、淋巴結的PTH值比較

2.4 免疫膠體金試紙法和納米碳法比較

試驗組為74例，對照組1為50例，兩組術前一般情況類似。術后第1天復查血鈣及血PTH情況，對照組1的血鈣及血PTH值略小于試驗組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 試驗組與對照組1 的術前、術后血鈣、血PTH 指標差異 （±s）

表3 試驗組與對照組1 的術前、術后血鈣、血PTH 指標差異 （±s）

項目術前血鈣（mmol/L）術前血PTH值（pg/mL）術后血鈣（mmol/L）術后血PTH值（pg/mL）試驗組2.309±0.119 45.400±11.406 2.073±0.167 35.767±13.159對照組1 2.307±0.116 43.565±12.605 2.043±0.167 34.570±11.620 t 0.10 0.76 0.88 0.48 P 0.918 0.447 0.379 0.630

2.5 免疫膠體金試紙法與常規(guī)肉眼法比較

試驗組為74例，對照組2為56例，兩組術前一般情況基本類似。術后試驗組血鈣及血PTH明顯高于對照組2（P＜0.05），提示免疫膠體金試紙法術后血鈣值及血PTH值高于常規(guī)肉眼法（表4）。

2.6 免疫膠體金試紙法與納米碳法低鈣反應發(fā)生率的比較

在試驗組與對照組1 中，試驗組74 例患者中發(fā)生低鈣反應4例，發(fā)生率5.4%，均為口周或四肢麻木，未出現(xiàn)抽搐或喉膈肌痙攣等嚴重癥狀；對照組1的50例患者中發(fā)生低鈣反應4 例，發(fā)生率8.0%，同樣為口周或四肢麻木，未出現(xiàn)更嚴重反應（Fisher精確檢驗，P=1.00，P＞0.05）。

2.7 免疫膠體金試紙法與常規(guī)肉眼法低鈣反應發(fā)生率的比較

在試驗組與對照組2 中，試驗組74 例患者中發(fā)生低鈣反應4例，發(fā)生率5.4%，均為口周或四肢麻木，未出現(xiàn)抽搐或喉膈肌痙攣等嚴重癥狀；而對照組2的56 例中8 例（14.3%）發(fā)生低鈣反應，其中7 例為口周或四肢麻木，1 例出現(xiàn)手部抽搐，未出現(xiàn)喉膈肌痙攣等嚴重癥狀（Fisher精確檢驗，P=0.202，P＞0.05）。

術后低鈣血癥患者均行相應補鈣處理，用藥后癥狀緩解。出院后仍存在低鈣血癥者，繼續(xù)口服鈣劑，1 個月后復查血清PTH、血鈣。全部出現(xiàn)低鈣血癥反應患者均恢復正常，考慮均為暫時性甲狀旁腺功能減退造成的一過性低鈣反應。所有患者均未出現(xiàn)永久性低鈣血癥。

2.8 費用時間比較

免疫膠體金試紙法費用僅40元，遠低于納米碳試劑及術中冰凍病理價格，且術中耗時短，準確性高。

3 討論

2018年美國甲狀腺學會關于成人患者術后甲狀旁腺功能減退癥的診斷、預防及管理聲明［3］指出，雙側（同期或分期）甲狀腺切除術最易導致術后低鈣血癥，且隨著手術范圍越大，手術時間越長，越易損傷甲狀旁腺［5］，通常是由于手術誤切或超聲刀、電刀等熱、電損傷以及甲狀旁腺的動脈血供及靜脈引流被阻斷。由于甲狀旁腺小，位置及枚數(shù)變異大，且顏色、形態(tài)與周圍淋巴結或脂肪近似，因此甲狀腺切除手術中意外切除或損傷甲狀旁腺，使其功能減退并不少見。有報道［6］全甲狀腺切除術后暫時性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率約20%～30%，永久性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率約1%～7%，暫時性甲狀旁腺功能低下會造成一過性低鈣癥狀，對患者生存質量的影響較短暫；但永久性甲狀旁腺功能低下會造成永久性低鈣癥狀，出現(xiàn)手足麻木和四肢抽搐，病情嚴重時可伴有喉肌和膈肌痙攣，引起窒息死亡，嚴重影響患者生存質量，成為醫(yī)療糾紛的主要因素［7］。而目前暫無甲狀旁腺激素替代療法，僅依靠服用鈣劑和維生素D暫時緩解癥狀，而長期服用會導致高鈣血癥、腎功能不全、基底核鈣質沉積和神經精神系統(tǒng)異常等并發(fā)癥，危害患者健康［8-9］。因此，提高術中識別率并保留甲狀旁腺是目前臨床醫(yī)生的重大挑戰(zhàn)。

納米碳是目前臨床應用最廣泛的甲狀旁腺負顯影技術，其具有較強的淋巴趨向性、快速示蹤、高度黑染率、時間持續(xù)長、與周圍組織色彩對比度高等特點［10］。Gu 等［11］研究表明，注射納米碳混懸液的患者術后血鈣濃度較未注射者明顯升高，且術后暫時性甲狀旁腺功能減退者有所下降。同樣有研究［12］認為納米碳費用較高，操作不當易污染術區(qū)視野，且未明顯減少術后低鈣血癥發(fā)生。近紅外熒光顯像技術既可以標記甲狀旁腺并可追溯其血供，但目前在試驗階段，需進一步證實和論證。對于伽馬射線探頭識別、放大顯微鏡下操作或接觸式內鏡、光學相干斷層成像術（optical coherence tomography，OCT）等方法各有優(yōu)勢。伽馬射線探頭識別目前成功經驗少，臨床醫(yī)師放射線防護等問題需進一步解決。放大鏡、內鏡等器械設備要求高，依舊是基于解剖基礎上的辨識，但對增強辨識作用有積極效果。而OCT 鑒別甲狀旁腺由于探頭尺寸及消毒方式限制，暫時僅用于試驗室離體組織中。目前，依舊不可避免因特殊解剖位置使得甲狀旁腺意外切除和血供破壞。綜上所述，尋找一種操作簡單、經濟、高效、損傷小的術中辨認甲狀旁腺方法尤為重要。

表4 試驗組與對照組2術前、術后血鈣、血PTH指標差異（±s）

表4 試驗組與對照組2術前、術后血鈣、血PTH指標差異（±s）

項目術前血鈣（mmol/L）術前血PTH值（pg/mL）術后血鈣（mmol/L）術后血PTH值（pg/mL）試驗組2.309±0.119 45.400±11.406 2.073±0.167 35.767±13.159對照組2 2.289±0.129 43.753±11.647 1.982±0.234 26.145±11.515 t 0.82 0.72 2.27 3.94 P 0.411 0.470 0.025 0.001

黃海燕等［13］率先運用細針穿刺組織測定甲狀旁腺，研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺組織與非甲狀旁腺組織穿刺洗脫液PTH呈顯著性差異。樊菁等［14］進行術中PTH快速檢測，選擇11例初診甲狀腺癌患者納入研究，術中遇到可疑甲狀旁腺時，首先由主刀醫(yī)生按照經驗主觀判斷，判斷為甲狀旁腺或非甲狀旁腺，進行記錄，對可疑甲狀旁腺進行PTH快速檢測，并取少量組織行術中冰凍。以冰凍病理結果為金標準對比醫(yī)師肉眼判斷及術中PTH。結果發(fā)現(xiàn)，肉眼經驗性判斷準確性為60%，敏感度為100%，特異度為11.1%，而術中PTH 快速檢測準確性為85%，敏感度為100%，特異度為66.7%，提示術中快速測定PTH可有效提高甲狀旁腺鑒別準確性與特異度，有助于甲狀旁腺保護及原位保留。張進軍等［15］選取106 例甲狀腺腺葉切除術患者，隨機分為常規(guī)肉眼組及PTH檢測組，常規(guī)肉眼組總符合率為74.1%，而PTH 法為96.2%，常規(guī)肉眼組暫時性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率為11.3%，而PTH組為5.7%。兩組術后永久性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率為3.8%和0。提示PTH 檢測法甲狀旁腺識別率高，可能會提高臨床甲狀旁腺發(fā)現(xiàn)率并降低相關甲狀旁腺功能減退發(fā)生率，但仍需大樣本研究進一步驗正。戴佳奇等［16］則將快速檢測PTH法（試驗組）與納米碳（對照組）法行對照研究，比較術前、術后血鈣、血磷、PTH 等。在良性病例中，試驗組術后血鈣、血PTH稍高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；在惡性病例中，試驗組術后血鈣稍高于對照組，血PTH明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。由此得出結論，術中使用快速檢測PTH法，有助于判別甲狀旁腺組織，盡可能避免誤傷或誤切甲狀旁腺，減少術后低鈣血癥發(fā)生率。

本研究采用免疫膠體金試紙法在術中快速檢測PTH，共117 組數(shù)據(jù)，成功率達100%，說明本研究術中穿刺檢測操作簡單易行，成功率穩(wěn)定。與術中快速病理對比后發(fā)現(xiàn)特異度為100%，敏感度為94.1%，準確率達97.4%，可快速、有效的識別甲狀旁腺組織。在76枚行冰凍病理證實為甲狀旁腺的組織中，11枚為原位甲狀旁腺血供較差，考慮存活可能性小，行甲狀旁腺自體移植；14枚為在Ⅵ區(qū)淋巴結清掃后，從清掃物中仔細尋找并辨認考慮為甲狀旁腺后進行穿刺測試，14枚中有2枚PTH測試結果＜65 ng/mL，為63.5 ng/mL以及62.1 ng/mL，但病理結果證實為甲狀旁腺。造成該穿刺結果為假陰性原因分析為：清掃物中分離出甲狀旁腺腺體較少，細針穿刺時穿破腺體，導致穿刺物較少。余41 例組織，分別為淋巴結26 例，脂肪10例，甲狀腺組織5 例，PTH 值均＜65 pg/mL。對照組2為常規(guī)肉眼組，按該術式方式，僅對無法原位保留的疑似甲狀旁腺行冰凍病理檢測，證實為甲狀旁腺組織后行自體移植，將甲狀旁腺用小刀或組織剪剪成＜1 mm 的薄片或碎粒種植于頓性分離后胸鎖乳突肌內。剩余51枚甲狀旁腺原位保留。

現(xiàn)今納米碳已是一種成熟可靠的甲狀旁腺判斷技術，本試驗中免疫膠體金試紙法術后血鈣及血PTH均值稍高于納米碳法，但差異無統(tǒng)計學意義，由此可見免疫膠體金試紙法檢測甲狀旁腺同樣安全可靠。納米碳費用高，且操作不當易造成黑染，影響手術視野，而免疫膠體金試紙法操作簡單，費用低，不但可用于檢測原位保留的甲狀旁腺，還可用于檢測需自體移植的甲狀旁腺驗證。

本研究中3 組行甲狀腺全切手術的病例中均未出現(xiàn)永久性甲狀旁腺損傷等嚴重并發(fā)癥，3組病例均出現(xiàn)低鈣反應?？紤]原因為雖然甲狀旁腺原位保留，但由于手術牽拉、術中解剖、能量器械的使用，造成短時間的甲狀旁腺供血不足。

術中對于需要進行自體移植的甲狀旁腺，應取其少量組織行冰凍病理學檢測證實。有報道［17］甲狀旁腺組織離體30 min 后開始出現(xiàn)空泡變形、細胞核變形、細胞內線粒體腫脹等細胞失活表現(xiàn)。有研究［18］認為冰凍病理學檢查會損失部分甲狀旁腺組織，延長移植甲狀旁腺時間，會使種植的甲狀旁腺功能下降，而越早進行甲狀旁腺自體移植，成活率越高。但冰凍病理一般時間為40 min，嚴重影響甲狀旁腺活性，且冰凍需要一定量組織進行，而本研究所用方法約10 min，在縮短時間的同時，減少甲狀旁腺損失。免疫膠體金試紙法價格僅為40元/次，低于納米碳試劑及術中冰凍病理價格。

綜上所述，常規(guī)肉眼法識別甲狀旁腺雖無經濟、時間成本，但需要術者具有豐富的經驗，對于資歷尚淺的年輕醫(yī)師存在一定困難。納米碳技術目前較為成熟，受較多國內外專家推崇，其可將淋巴結顯影，從而較好保護甲狀旁腺，減少甲狀旁腺功能減退。從試驗結果分析，其術后血鈣及血PTH 與免疫膠體金法結果相似。但納米碳費用高，且操作不當影響手術視野。

根據(jù)目前加速康復外科（enhanced recovery after surgery，ERAS）理念［19］，術中應用免疫膠體金試紙正確識別甲狀旁腺后，緊貼甲狀腺固有背膜操作，精細化解剖，盡量達到原位保留，術后減少患者的生理及心理創(chuàng)傷應激，加速患者康復，并繼續(xù)監(jiān)測患者外周靜脈血情況，及時補鈣，可有效縮短住院時間、降低醫(yī)療費用及減輕社會家庭經濟負擔。